СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАРГЕТНОЙ ДНК УРОГЕНИТАЛЬНЫХ МИКОПЛАЗМ, ВЫРАЩЕННЫХ НА СЕЛЕКТИВНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ, ДЛЯ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/6806 C12Q1/34 C07H21/04 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, касается способа получения таргетной ДНК клинических изолятов урогенитальных микоплазм и может быть использовано в научно-исследовательской практике с целью получения высококачественной библиотеки ДНК для последующего полногеномного секвенирования.

Микоплазмы составляют особый обширный класс микроорганизмов, отличительными чертами которых являются малые размеры жизнеспособных частиц, близкие к размерам вирусов; отсутствие клеточной стенки; содержание в клетках ДНК и РНК в отличие от вирусов, имеющих одну из кислот; способность расти на бесклеточных питательных средах; размножение путем бинарного деления, как и у бактерий; полиморфизм клеток - кроме обычных овоидных клеток, имеются нитевидные, звездчатые, почкующиеся формы; на плотных питательных средах микоплазмы образуют колонии, имеющие вросший в среду центр и ажурную периферию, в организме прикрепляются к мембране клетки (мембранные паразиты); рост микоплазм подавляют тетрациклины, макролиды; фторхинолоны; микоплазмы обладают природной устойчивостью к действию антибиотиков, ингибирующих синтез клеточной стенки (пенициллины, рифампицины, налидиксовая кислота и др.).

По месту обитания микоплазмы, живущие в организме человека, делятся на орофарингеальные и урогенитальные виды. Наиболее часто из гениталий выделяют Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis. М. hominis и U. urealyticum присутствуют в уретре, влагалище, прямой кишке у 20-75% здоровых людей. Отсутствие достаточно надежных и достоверных эпидемиологических исследований затрудняет анализ распространенности генитальных микоплазм. Однако многочисленные публикации свидетельствуют о значительном удельном весе воспалительных заболеваний, ассоциированных с урогенитальными микоплазмами. По некоторым данным, более чем у 40% больных с воспалительными заболеваниями урогенитальной системы выявляются урогенитальные микоплазмы. При этом наибольшее клиническое значение имеют М. genitalium, U. urealyticum и М. hominis.

Урогенитальные микоплазмы способны вызывать уретрит, цервицит и другие воспалительные заболевания органов малого таза, влиять на течение и исход беременности, а также вызывать инфекционные заболевания у новорожденных. Распространенность М. genitalium среди мужчин без признаков уретрита колеблется от 0 до 17,7%. При негонококковых уретритах эти микроорганизмы обнаруживают в 11,5% - 41,7% (в среднем 19,8%) наблюдений, а при негонококковых нехламидийных уретритах - в 3-54,5%. У женщин с признаками воспалительных заболеваний органов малого таза в 7-10% случаев в образцах шейки матки и/или эндометрия были выделены М. genitalium. Частота обнаружения U. urealyticum и М. hominis широко варьирует в различных популяционных группах, составляя от 10% до 50% (по данным ряда авторов, - до 80%). Следует отметить, что уреаплазмы и М. hominis нередко выявляются у клинически здоровых лиц и, являясь условно-патогенными микроорганизмами, они могут в норме колонизировать органы урогенитальной системы. Однако при определенных условиях эти микроорганизмы могут потенцировать развитие воспалительных процессов мочеполового тракта. В этиологической классификации Всемирной Организации Здравоохранения (2006 г.) и синдромальной классификации Центров по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention - CDC) U. urealyticum и M. hominis выделены как возможные этиологические агенты неспецифических негонококковых уретритов, воспалительных заболеваний органов малого таза и бактериального вагиноза [1, 2, 3].

Основными методами лабораторной диагностики урогенитальных инфекций являются культуральные и молекулярно-генетические. Микроскопические методы не нашли применения из-за большой вариабельности морфологии возбудителей (кокковидная, палочковая, нитевидная формы, в виде «зерен», «цепочек» и т.д.) и их нечеткого отношения к окраске по Граму. Серологические методы остаются неразработанными из-за низкого уровня формирующихся при заболеваниях антител, а также отсутствия четкого видового антигенного различия у разных возбудителей [4]. Бактериологическая диагностика - «классический» доказательный метод, используемый для выделения М. hominis и U. urealyticum. Этот метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, а также возможностью определения этиологически значимого количества возбудителя в исследуемом материале. Следует отметить, что на эффективность индикации и идентификации урогенитальных микоплазм влияют качество отобранного для исследования материала, спектр используемых питательных сред и условия культивирования. Необходимо строго соблюдать правила отбора, хранения и транспортирования образцов биологического материала. Для проведения диагностических тестов используются коммерческие жидкие и твердые селективные питательные среды, позволяющие определить титр (клинически значимую концентрацию) возбудителя.

Методы молекулярной диагностики, основанные на амплификации специфических фрагментов ДНК, отличаются высокой чувствительностью и специфичностью (>90%), позволяют исследовать любой клинический материал, включая образцы, содержащие единичные бактериальные клетки возбудителей инфекционных болезней. Матрицей для молекулярных методов диагностики является бактериальная нуклеиновая кислота, концентрация и степень чистоты которой должна соответствовать требованиям применяемых аналитических методов. С целью изучения молекулярно-генетических особенностей урогенитальных микоплазм и, в первую очередь, генов, ответственных за проявление устойчивости к антибактериальным препаратам, используются методы частичного и полногеномного секвенирования. В настоящее время полногеномное секвенирование, обладающее наибольшей разрешающей способностью, стало возможным благодаря появлению высокопроизводительных секвенаторов, работающих по принципу массированного параллельного секвенирования - NGS (Next Generation Sequencing). Для получения качественных результатов полногеномного секвенирования необходимо иметь образец ДНК культур урогенитальных микоплазм (M. hominis, U. urealyticum, U. parvum, М. genitalium) в достаточном количестве и высокой степени чистоты, что достигается путем обогащения образца целевой ДНК при культивировании клинического материала (соскоб клеток эпителия вагины и/или цервикального канала, уретры) на селективных питательных (жидких и твердых) средах. Однако полученный в результате выделения образец суммарной ДНК содержит как целевую ДНК урогенитальных микоплазм, так и ДНК нецелевых микроорганизмов и человека. Наличие нецелевой ДНК негативно влияет на качество результатов полногеномного секвенирования и стоимость проводимого исследования.

Для выделения ДНК из культуры U. urealyticum или М. hominis существуют следующие способы:

1. с использованием фенольно-хлороформного метода, включающего ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и осаждением ДНК [5];

2. с использованием сорбционного метода, включающего лизирование бактерий гуанидинтиоционатом, осаждение ДНК на частицы силикагеля, ее очистка и концентрирование путем обработки изопропанолом и 70% этанолом [6].

Однако эти способы не обеспечивают выделения таргетной (целевой) ДНК урогенитальных микоплазм, что обусловлено наличием в полученных образцах суммарной ДНК, включая нецелевую.

В настоящее время в литературе способ выделения таргетной (целевой) ДНК урогенитальных микоплазм из клинического образца, содержащего ДНК человека и различных микроорганизмов (бактерий, вирусов), не описан.

Задача изобретения - разработка нового способа получения таргетной ДНК урогенитальных микоплазм (М. hominis и/или U. urealyti-cum/parvum), выращенных на селективной питательной среде, высокой степени чистоты.

Задача решается способом получения таргетной (целевой) ДНК урогенитальных микоплазм (М. hominis и/или U. urealyticum/parvum), заключающимся в предварительной обработке жидкого культурального образца с концентрацией живых клеток урогенитальных микоплазм не менее 10⁶ КОЕ/мл и выделении таргетной (целевой) ДНК магносорбционным методом, причем предварительную обработку осуществляют раствором, содержащим ДНКазу (100 U) и 10-ти кратный буфер состава 100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ (рН 7,5) с последующим ингибированием активности фермента нагреванием.

Способ осуществляется следующим образом:

Для получения жидкого культурального образца, содержащего урогенитальные микоплазмы (М. hominis или U. urealyticum/parvum), исходный клинический образец (соскоб клеток эпителия вагины и/или цервикального канала, уретры) культивируют на жидкой питательной среде при температурном и временном оптимуме. Жидкий культуральный образец с концентрацией живых клеток урогенитальных микоплазм не менее 10⁶ КОЕ/мл обрабатывают раствором, содержащим ДНКазу (100 U) и 10-ти кратный буфер состава 100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂ 1 mM CaCl₂ (рН 7,5) (конечная концентрация буфера в образце должна быть однократной), в течение 30±10 минут при температуре 37°±1°С, реакцию останавливают прогреванием в течение 10 мин при 75°±1°С с последующей очисткой таргетной высокомолекулярной ДНК урогенитальных микоплазм от нецелевых коротких фрагментов, образующихся в результате обработки ДНКазой, с помощью магнитных шариков, отмывкой 80% этанолом и элюцией ТЕ-буфером.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Выделение ДНК Mycoplasma hominis.

Образцы соскобов эпителия цервикального канала (вагины, уретры) из транспортной среды культивировали на коммерческой жидкой дифференциально-диагностической среде производства ЦНИИЭ (Москва, РУ № ФСР 2008/03366) в анаэробных условиях при температуре 37°±1°С в течение 48-96 часов. 90 мкл культурального образца с концентрацией М. hominis не менее 10⁶ КОЕ/мл обрабатывали 15 мкл раствора, содержащего 5 мкл ДНКазы (100 U) и 10 мкл 10-ти кратного буфера состава 100 mM Tris-HCl (рН 7.5), 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ (рН 7,5) (конечная концентрация буфера в образце - однократная) в течение 30 минут при температуре 37°±1°С. Реакцию останавливали прогреванием в течение 10 минут при температуре 75°±1°С.Проводили очистку полученного лизата от фрагментов нецелевой ДНК с помощью магнитных шариков в соотношении 2,2× к объему образца. Образец с шариками инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем пробирку переносили на магнитный штатив. После осветления полученного образца путем осаждения всех шариков на стенке пробирки вокруг магнита осветленный супернатант, содержащий фрагменты нецелевой ДНК, аккуратно удаляли. Магнитные шарики дважды промывали 400 мкл 80% этанола. После второй отмывки этанол полностью удаляли. Для полного испарения остатков этанола пробирки с открытой крышкой переносили в термостат, нагретый до 60°±1°С, инкубировали в течение 10 минут. Затем для элюции целевой ДНК с шариков в пробирки вносили 50 мкл ТЕ-буфера, шарики ресуспендировали, инкубировали в течение 5 минут при температуре 60°±1°С, затем еще в течение 10 минут при комнатной температуре. Пробирки устанавливали на магнитный штатив, после осветления супернатант переносили в чистые пробирки. Выделение ДНК из контрольных образцов проводили без предварительной обработки. Концентрацию ДНК определяли с использованием флуориметра "Qubit" (производства Introgen, Австрия). Концентрация свободной ДНК в культуральных образцах (опыт, контроль) - 4,1 нг/мкл, после обработки опытных образцов в соответствии с заявляемым способом она снизилась до 2,63 нг/мкл и составила после выделения 0,27 нг/мкл против 0,84 нг/мкл в контрольных образцах.

Пример 2. Выделение ДНК Ureaplasma urealyticum

Образцы соскобов эпителия цервикального канала из транспортной среды культивировали на жидкой дифференциально-диагностической средепроизводства ЦНИИЭ (Москва, РУ № ФСР 2008/03366) в анаэробных условиях при температуре 37°±1°С в течение 48-96 часов. Выделение ДНК и определение ее концентрации проводили, как в примере 1. Концентрация свободной ДНК в культуральных образцах (опыт, контроль) - 3,22 нг/мкл, после обработки опытных образцов в соответствии с заявляемым способом она снизилась до 0,4 нг/мкл, концентрация ДНК после очистки на магнитных шариках составила 0,46 нг/мкл против 0,77 нг/мкл в контрольном образце.

Сохранение целевой ДНК после обработки ДНКазой в соответствии с заявляемым способом было подтверждено результатами ГЩР с использованием коммерческих тест-систем типа «АмплиСенс Mycoplasma hominis-Eph» и «АмплиСенс U. urealyticum/U. parvum-Eph» с электрофоретической детекцией продуктов амплификации (производства ЦНИИЭ, г. Москва).

Приведенные примеры подтверждают, что заявляемый способ позволяет получить таргетную ДНК урогенитальных микоплазм, выращенных в жидкой селективной питательной среде, пригодную для проведения полногеномного секвенирования на платформе MiSeq и обеспечивает повышение качества (количество чтений, покрытие) результатов полногеномного секвенирования. Для заявляемого способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных средств и методов.

Источники информации, принятые во внимание:

1. Раковская, В.И. Микоплазмы и микоплазменные инфекции / И.В. Раковская // Вестник дерматологии и венерологии. - 2008. - №5. - С. 60-65.

2. Руденкова, Т.В. Микробиологические свойства и генетические особенности микоплазм /Т.В. Руденкова, В.В. Дорошевич, С.А. Костюк, Н.Л. Андреева, Н.А. Бадыгина, О.С. Полуян // Медицинские новости. - 2011. - №8. - С. 13-16.

3. Савичева, A.M. Генитальные микоплазмы - проблемы диагностики и лечения/ A.M. Савичева, Е.В. Шипицына, М.А. Башмакова // Клиническая дерматология и венерология. - 2008. - №6. - С. 80-90.

4. Борхсениус, С.Н. Микоплазмы. Молекулярная и клеточная биология, взаимодействие с иммунной системой млекопитающих, патогенность, диагностика / С.Н. Борхсениус, О.А. Чернова, В.М. Чернов, М.С. Вонский // СПб: Наука. - 2002. - 319 с

5. Knox, Ch. L. Comparison of PCR, nested PCR, and random amplified polymorphic DNA PCR for detection and typing of Ureaplasma urealyticum in specimens from pregnant women / Ch. L. Knox, P. Timms//J. ClinMicrobiol. - 1998. - Vol. 36. - №10. - P. 3032-3039.

6. Патент Республики Беларусь №11321 C1, 2008.12.30.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения таргетной ДНК клинических изолятов урогенитальных микоплазм. Жидкий культуральный образец с концентрацией живых клеток не менее 10⁶ КОЕ/мл предварительно обрабатывают раствором, содержащим ДНКазу (100 U) и 10-кратный буфер состава 100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ (рН 7,5) (конечная концентрация буфера в образце должна быть однократной). Обработку проводят в течение 30±10 минут при температуре 37±1°С. Затем осуществляют ингибирование активности фермента нагреванием в течение 10 минут при 75±1°С и очистку таргетной ДНК магносорбционным способом. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательской практике для получения высококачественной библиотеки ДНК с целью проведения последующего полногеномного секвенирования. 2 пр.

Способ получения таргетной ДНК урогенитальных микоплазм, выращенных на селективной питательной среде, отличающийся тем, что жидкий культуральный образец с концентрацией живых клеток урогенитальных микоплазм не менее 10⁶ КОЕ/мл предварительно обрабатывают раствором, содержащим ДНКазу (100 U) и 10-кратный буфер состава 100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ (pH 7,5) (конечная концентрация буфера в образце однократная) в течение 30±10 минут при температуре 37±1°С, с последующим ингибированием активности фермента нагреванием в течение 10 минут при температуре 75±1°С и очисткой таргетной ДНК магносорбционным способом.