ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО "КУМАЗИД" И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/56 A61P37/02 

Описание патента на изобретение RU2271820C1

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к созданию иммуномодулирующих средств животного происхождения и фармацевтических композиций на их основе, которые могут найти применение в качестве стимуляторов неспецифического иммунитета у животных и человека для профилактики и лечения различных заболеваний.

Известно, что тритерпеновые гликозиды из кукумарии японской (Cucumaria japonica) являются активными иммуномодуляторами, в частности они в низких дозах увеличивают активность макрофагов (Aminin D.L. et. al. Immunomodulatory Properties of Cucumariosides from Edible Far-Eastern Holothurian Cucumaria japonica. J. Med. Food. 2001. V.4, №3. P.127-135; Agafonova I.G. et al. Influence of Cucumariosides upon Intracellular [Ca2+]i and Lysosomal Activity of Macrophages. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003. V.51. P.6982-6986), увеличивают антителообразование и эффективность вакцинирования (Седов А.М. и др. Влияние кукумариозида (тритерпенового гликозида из голотурий Cucumaria japonica) на развитие иммунного ответа мышей на корпускулярную коклюшную вакцину. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 1984, №5, с.55-58). Кукумариозиды оказывают стимулирующее влияние на антибактериальную устойчивость на модели экспериментального сальмонеллеза мышей и к условно патогенным грамотрицательным микроорганизмам (Седов А.М. и др. Способность тритерпеновых гликозидов из голотурий стимулировать антибактериальную устойчивость на модели экспериментального сальмонеллеза мышей. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 1984, №5, с.555-558).

Известно применение тритерпеновых гликозидов голотурий в качестве средства для изучения состояния иммунной системы на экспериментальных моделях (авторское свидетельство №1066602, А 61 К 35/56, 1984).

Описана антифунгальная активность кукумариозидов, полученных из отвара голотурии Cucumaria japonica путем концентрирования отвара, осаждения белков этиловым спиртом, экстракции гликозидов н-бутиловым спиртом, очистки экстракта этиловым спиртом и осаждения гликозидов ацетоном (авторское свидетельство №1166371, А 61 К 35/56, С 07 Н 15/24, 1985).

Известно средство для профилактики и лечения алеутской болезни норок (патент РФ №2036654, А 61 К 35/56, 1995). Описано применение как суммарного препарата тритерпеновых гликозидов (КМ), полученного способом, описанным в авторском свидетельстве №1166371, так и применение индивидуального гликозида - кукумариозида (КМ-2). Последний выделяют из спиртового экстракта голотурии Cucumaria japonica последовательно колоночной хроматографией на силикагеле и полихроме.

Обнаружена эффективность кукумариозидного препарата как радиопротектора для профилактики и лечения лучевой болезни в экспериментах с лабораторными животными (патент РФ №2141833, А 61 К 35/56, 1999). Показана выраженная активность кукумариозидного препарата против ряда вирусов (патент РФ №2184556, А 61 К 35/56, 31/7048, А 61 Р 31/12, 2002).

Известен препарат из кукумарии японской - кукумариозид (КД), использующийся в ветеринарии в качестве иммунодулирующего и биостимулирующего средства для профилактики заболеваний животных и снижения падежа молодняка (ТУ 08064-19-04-95; Наставление по применению кукумариозида (КД) в ветеринарии N 10.07.184-95 от 26.01.1995, Регистрационное удостоверение N Р004-2.0105; Номер государственной регистрации препарата: ПВР 2.01.0001-95). Кукумариозид (КД) представляет собой суммарную фракцию тритерпеновых гликозидов. Препарат получали из отвара голотурии Cucumaria japonica способом, описанным в авторском свидетельстве №1166371. В дальнейшем был разработан усовершенствованный способ получения суммы тритерпеновых гликозидов из выварочных вод этого животного, согласно которому целевой продукт выделяют путем соосаждения гликозидов с полисахарид-белковым комплексом при подкислении до рН 2,8 или при добавлении 1% раствора хитозана в качестве флокулянта, а затем экстрагируют их из комплекса и очищают с помощью обращенно-фазовой хроматографии на колонках с гидрофобным сорбентом, а затем с силикагелем (патент РФ №2110522, С 07 Н 3/06, 1998).

Исследования гликозидов дальневосточной голотурии Cucumaria japonica, проводимые в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН, показали, что кукумария японская содержит сложную смесь тритерпеновых гликозидов голостанового ряда (0,2-0,3% от веса сухого остатка животного), дающего на хроматограмме (ТСХ) семь основных пятен. Каждое из пятен представляет собой подфракцию родственных гликозидов, имеющих одинаковые углеводные цепи, но различающихся строением агликонов. Они объединены в группы и получили обозначения А0 (˜3% от веса суммарной гликозидной фракции). А1 (5%), А2 (17%), А3 (7%), А4 (13%), А6 (14%) и А7 (26%). Гликозиды, входящие в А0, A1, А2 и А4 группы, относятся к моносульфатированным гликозидам, оликозиды А3 и А6 групп - к дисульфатированным гликозидам, а А7 группы - к трисульфатированным гликозидам (Авилов С.А и др. Строение четырех новых тритерперовых гликозидов из морской голотурии Cucumaria japonica // Химия природ. соед. 1990. №6. С.787-793; Дроздова О.А. и др. Трисульфатированные гликозиды из морской голотурии Cucumaria japonica // Химия природ. соед. 1993. №3. С.369-374; Drozdova О.А. et. al. Cytotoxic triterpene glycosides from Far-Eastern sea cucumber belonging to the genus Cucumaria. Liebigs Ann. 1997, 11, 2351-2356; Stonik V.A. et. al. Toxins from sea cucumbers (Holothuroids): chemical structures, properties, taxonomic distribution, biosynthesis and evolution. J. Nat. Toxins 1999, 8 (2), 235-248).

Обнаружено, что не все гликозиды кукумарии японской стимулируют иммунную систему, некоторые из них, в частности ди- и трисульфатированные компоненты гликозидной фракции, не активны или даже обладают иммуносупрессивными свойствами (Aminin D.L. et. al. Immunomodulatory Properties of Cucumariosides from Edible Far-Eastern Holothurian Cucumaria japonica. J. Med. Food. 2001. V.4, №3. P.127-135). С этим может быть связана неоднозначность действия кукумариозидных препаратов, полученных разными способами и из разных сборов биологического сырья, которая иногда проявляется в диаметрально противоположных иммунотропных эффектах. Кроме того, их медицинское применение тормозится относительно высокой токсичностью. Так, LD50 препарата КД составляет 25-30 мг/кг.

Противоопухолевая активность препарата КД не описана.

Задача изобретения - создание средства животного происхождения и фармацевтической композиции на его основе, обладающих иммуномодулирующей активностью.

Поставленная задача решена новым иммуномодулирующим средством, характеризующимся тем, что оно представляет собой комплекс моносульфатированных кукумариозидов со стерином при молярном соотношении кукумариозиды:стерин 1:2, полученный при добавлении к экстракту кукумарии японской Cucumaria japonica, или к экстракту выварочных вод - отходов при переработке кукумарии японской, или к раствору суммы кукумариозидов раствора стерина.

Новое средство получило название «кумазид».

Анализ кумазида с помощью тонкослойной хроматографии и ЯМР спектров показал, что в его состав входят в основном активные моносульфатированные кукумариозиды А2 и А4 групп. В кукумариозид-стериновом комплексе мало активные и обладающие иммуносупрессорным действием ди- и трисульфатированные кукумариозиды являются примесями, содержание которых не превышает 5-10%.

В качестве раствора стерина используют раствор холестерина или раствор ситостерина.

Технический результат заключается в уменьшении токсичности иммуномодулирующего средства.

Кроме того, достигается дополнительный технический результат, заключающийся в проявлении у заявляемого иммуномодулирующего средства противоопухолевой активности.

Задача решена также созданием новой иммуномодулирующей фармацевтической композиции. Она содержит заявляемое средство и наполнитель при следующем их соотношении, %: кумазид - 0,1-1,0 и наполнитель - остальное.

Испытания показали, что действующая доза для мышей весом 20 г составляет от 0,02 мкг до 0,2 мкг на мышь При пересчете на кг веса действующая доза кумазида составляет (1,0-10,0) мкг. Этот диапазон доз является оптимальным, уменьшение или превышение этих значений приводит к снижению эффективности кумазида. Эффективное количество кумазида в композиции определено исходя из действующей дозы активного начала, которая находится в интервале от 1,0 мкг до 10,0 мкг на кг веса.

Для человека со средним весом 50 кг заявляемая фармацевтическая композиция в виде таблетки весом 50 мг содержит от 0,05 мг (0,1%) до 0,5 мг (1,0%) кумазида и наполнитель - остальное. В качестве наполнителя используют стандартные вещества, нейтральные к кумазиду, выбранные из группы: крахмал, гипс, стеарат кальция, стеарат магния, сорбит, лактоза.

Технический результат заключается в уменьшении токсичности фармацевтической композиции. Кроме того, достигается дополнительный технический результат, заключающийся в проявлении у заявляемой фармацевтической композиции противоопухолевой активности.

Изучение биологической активности заявляемого средства и фармацевтической композиции на его основе в экспериментах in vitro и in vivo показало, что они обладают высокой иммуномодулирующей активностью (стимулируют лизосомальную активность макрофагов в 2-2,5 раза по сравнению с контрольными клетками), сравнимой с иммуномодулирующей активностью суммарного гликозидного препарата из Cucumaria japonica (КД), но выгодно отличаются от него низкой гемолитической и цитотоксической активностями (ГК50 порядка 50 мкг/мл для кумазида и порядка 2,5 мкг/мл для КД).

Известно, что токсичность гликозидных препаратов из голотурий определяется в основном их гемолитическими свойствами, а именно чем выше их гемолитическая активность, тем большей токсичностью характеризуются эти препараты (Kalinin V.I. et. al. J. Nat. Toxins. 1992. V.1, №2. P.17-30).

Исследования показали, что заявляемое средство и фармацевтическая композиция на его основе отличаются значительно меньшей гемолитической и цитотоксической (эмбриотоксической) активностями, чем известный препарат КД. Как следует из фиг.1А, кумазид показывает приблизительно в 20 раз меньшую гемолитическую активность, чем препарат КД.

Независимо от используемого при образовании комплексов стерина наблюдали приблизительно одинаковое уменьшение цитотоксических свойств в сравнении с препаратом КД. Так, для кумазида, представляющего собой комплекс моносульфатированных кукумариозидов с ситостерином, наблюдалось существенное уменьшение эмбриотоксичности (ЭД50 для препарата КД равна 1,5 мкг/мл, а для кумазида - 6,0 мкг/мл) (фиг.1Б).

Показано, что кумазид при двукратной внутрибрюшинной инъекции в дозе 8,0 мкг/мл вызывает достоверное торможение роста асцитной формы карциномы Эрлиха порядка 27% по сравнению с контрольными животными на ранних стадиях развития опухоли. При двукратной внутрибрюшинной инъекции в дозе 10 мкг/кг существенно в 3,2 раза по сравнению с контролем тормозит развитие солидной формы мышиной карциномы Эрлиха на ранней стадии развития опухоли, оцененной на 6-й день после инокуляции. Однако на более поздних стадиях опухоль быстро прогрессирует.

Во всех типах экспериментов препарат кумазид вводили за несколько дней до имплантации опухоли в животных по так называемой «профилактической» схеме в дозах, гораздо ниже цитотоксических и имеющих иммуностимулирующий эффект. Наблюдаемое торможение роста опухоли (как в асцитной, так и в солидной форме) на ранней стадии ее развития у животных после введения препарата кумазид можно отнести за счет иммуномодулирующих свойств препарата.

Обнаружено, что комплексы кукумариозидов со стеринами более стабильны и отличаются большей всасываемостью по сравнению с аналогичными свойствами суммарного гликозидного препарата из кукумарии японской.

На фиг.1 представлена сравнительная гемолитическая активность кумазида, представляющего собой комплекс кукумариозидов с холестерином в виде водной суспензии и известного кукумариозидного препарата КД по отношению к мышиным эритроцитам (А), и эмбриотоксическая активность кумазида, представляющего собой комплекс кукумариозидов с ситостерином, и препарата КД по отношению к развивающимся эмбрионам морского ежа (Б).

На фиг.2 представлены данные, показывающие величину лизосомальной активности мышиных перитонеальных макрофагов, проявляемой кумазидом в сравнении с КД и с контролем. (А) - пероральное ежедневное введение препарата в виде водной суспензии. Регистрация на 10 день эксперимента. (Б) - интраперитонеальная однократная инъекция препарата в виде водной суспензии. Регистрация на 4 день. Концентрация КД в растворе - 0,02 мкг/мл, концентрация кумазида в суспензии - 0,02 мкг/мл.

На фиг.3 и 4 представлена зависимость величины лизосомальной активности мышиных перитонеальных макрофагов от длительности приема кумазида в таблетированной форме.

На фиг.5 представлены данные по влиянию препарата Кумазид на раннюю стадию роста солидной карциномы Эрлиха у мышей. Препарат вводили дважды за 4 и за 1 день до инокуляции опухоли в дозе 0,2 мкг/мышь. Количество клеток вводимой опухоли - 5 млн на мышь. Количество животных в опыте - 2 в каждой группе. Данные представлены как m±sd (n=2).

Получение, физико-химические характеристики и исследование биологической активности кумазида и фармацевтической композиции на его основе представлены в следующих примерах осуществления изобретения.

Пример 1. Получение кумазида из кожно-мышечных мешков кукумарии японской.

Потрошеную кукумарию японскую (Cucumaria japonica) (1 кг) измельчают и экстрагируют спиртом (2 л) при нагревании в течение 4 часов. Экстракт отделяют декантацией, остаток повторно экстрагируют спиртом в тех же условиях. Объединенный экстракт центрифугируют при 4000 об/мин 20 минут. Супернатант отделяют, упаривают до воды и экстрагируют бутанолом (2×200 мл). Верхнюю фазу отделяют, профильтровывают и добавляют к ней раствор холестерина (1 г) в 60 мл водно-насыщенного бутанола. Реакционный раствор концентрируют в вакууме до объема 200 мл, образовавшуюся суспензию выдерживают 10-14 часов при 4-6°С и центрифугируют. Образующийся осадок, представляющий собой кукумариозид-холестериновый комплекс, отделяют от надосадочной жидкости и трижды промывают комплекс равными объемами охлажденного растворителя (спирт, эфир или другие) с последующим центрифугированием. Затем осадок отмытого комплекса несколько раз промывают равными объемами серного эфира с последующим центрифугированием и высушиванием сначала на воздухе до отсутствия запаха эфира, а затем в вакуум-эксикаторе до постоянного веса. Получают 220 мг кукумариозид-холестеринового комплекса (кумазида). Он представляет собой чуть желтоватый или бесцветный аморфный порошок, не растворимый в воде, неполярных растворителях и слабо растворимый в спиртах. Содержание основного вещества не менее 95%. Белковые примеси не более 2%, [α]d20=-36°±5°, пиридин, концентрация 1,5 мг/мл. Молярное сооотношение кукумариозиды:стерин равно 1:2. На фиг.6 приведен ЯМР-спектр.

Пример 2. Получение кумазида осуществляют, как описано в примере 1, но в качестве раствора стерина используют раствор ситостерина. Получают 220 мг кукумариозид-ситостеринового комплекса (кумазида). Он представляет собой желтоватый или бесцветный аморфный порошок, не растворимый в воде, неполярных растворителях и слабо растворимый в спиртах. Содержание основного вещества не менее 95%. Белковые примеси не более 2%, [α]d20=-32°±5°, пиридин, концентрация 1,5 мг/мл. Молярное сооотношение кукумариозиды:стерин равно 1:2.

Пример 3. Получение кумазида из выварочных вод - промышленных отходов при переработке кукумарии японской.

К выварочным водам (10 л) добавляют уксусную кислоту до рН 4 (по универсальной индикаторной бумаге). Образовавшемуся осадку дают отстояться 10-14 часов. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют спирт 1:1 по объему. Экстрагируют 4 часа при нагревании, центрифугируют при 4000 об/мин 20 минут и осадок дважды промывают равными объемами 60% спирта, объединенный экстракт упаривают до воды. Далее процесс ведут, как описано в примере 1. Получают 20 мг кумазида. Он представляет собой чуть желтоватый или бесцветный аморфный порошок, не растворимый в воде, неполярных растворителях и слабо растворимый в спиртах. Содержание основного вещества не менее 95%. Белковые примеси не более 2%, [α]d20=-36°±5°, пиридин, концентрация 1,5 мг/мл. Молярное сооотношение кукумариозиды:стерин равно 1:2. На фиг.7 приведен ЯМР-спектр.

Пример 4. Получение кумазида осуществляют, как описано в примере 3, но в качестве раствора стерина используют раствор ситостерина. Получают 13 мг препарата. Он представляет собой желтоватый или бесцветный аморфный порошок, не растворимый в воде, неполярных растворителях и слабо растворимый в спиртах. Содержание основного вещества не менее 95%. Белковые примеси не более 2%, [α]d20=-32°±5°, пиридин, концентрация 1,5 мг/мл. Молярное сооотношение кукумариозиды:стерин равно 1:2.

Пример 5. Получение кумазида из раствора суммы кукумариозидов.

А. Получение раствора суммы кукумариозидов.

Свежевыловленную кукумарию (100 кг) разрезают на куски, удаляют воду, пропускают через мясорубку, заливают этиловым спиртом (1:1 по объему). Пассивная экстракция при температуре 25°С проходила 3 дня. Первый экстракт сливают и остаток заливают 80% этиловым спиртом. Последовательно получено три водно-спиртовых экстракта, которые объединяют и упаривают в вакууме при 70°С до воды. Водный остаток (23 л) экстрагируют бутанолом 4 раза в соотношении вода:бутанол - 4:1 по объему. Получают 16 л бутанольного экстракта, который упаривают в вакууме при 50°С до объема в 9 литров. При охлаждении этого экстракта в холодильнике (+5°С) (12 часов) выпадает осадок, который отделяют центрифугированием (15 мин при 2000 об\мин). Осадок промывают 3 раза системой хлороформ-гексан 1:1 (по 70 мл), высушивают на воздухе 48 часов, затем в вакууме до постоянного веса в течение 28 часов. ТСХ - анализ подтвердил наличие моносульфатированных гликозидов в осадке (КД5).

5,5 г КД5 растворяют в 70 мл воды, отфильтровывают и прибавляют 400 мл подогретого до 50°С бутанола. После охлаждения добавляют воды так, чтобы образовалось 5-6 мл водного слоя, перемешивают и водный слой убирают. Для дальнейшей работы используют раствор гликозидной фракции в бутаноле при комнатной температуре.

Б. Получение кумазида.

Холестерин (3,5 г) растворяют при нагревании в 50 мл водно-насыщенного бутанола. При охлаждении до комнатной температуры этот раствор должен оставаться прозрачным. Затем растворы холестерина и гликозидной фракции смешивают и оставляют в холодильнике на ночь. Образовавшийся осадок кукумариозид-холестеринового комплекса отделяют центрифугированием 15 мин, 2000 об\мин. Осадок промывают охлажденным этиловым спиртом (2×80 мл), затем серным эфиром (3×40 мл). Выход 2,74 г. Полученный кумазид сушат на воздухе 48 часов, затем в вакууме до постоянного веса (24 часа). ТСХ-анализ подтвердил, что он состоит из комплекса моносульфатированных кукумариозидов и холестерина. Он представляет собой желтоватый или бесцветный аморфный порошок, не растворимый в воде, неполярных растворителях и слабо растворимый в спиртах. Содержание основного вещества не менее 95%. Белковые примеси не более 2%, [α]d20=-35°±5°, пиридин, концентрация 1,5 мг/мл. Молярное сооотношение кукумариозиды:стерин равно 1:2.

Пример 6. Получение кумазида осуществляют, как описано в примере 5, но в качестве раствора стерина используют раствор ситостерина. Получают 2,74 г препарата. Полученный кумазид сушат на воздухе 48 часов, затем в вакууме до постоянного веса (24 часа). ТСХ-анализ подтвердил, что он состоит из комплекса моносульфатированных кукумариозидов и ситостерина. Он представляет собой желтоватый или бесцветный аморфный порошок, не растворимый в воде, неполярных растворителях и слабо растворимый в спиртах. Содержание основного вещества не менее 95%. Белковые примеси не более 2%, [α]d20=-32°±5°, пиридин, концентрация 1,5 мг/мл. Молярное соотношение кукумариозиды:стерин равно 1:2.

Пример 7

Фармацевтическая композиция содержит кумазид в качестве активного начала, а также наполнитель, состоящий из картофельного крахмала и гипса, при следующем соотношении компонентов, мг:

Кумазид 0,05Крахмал картофельный 45,0Гипс 5,0

Фармацевтическую композицию готовят следующим образом. Соответствующие количества картофельного крахмала и гипса смешивают, а затем вносят в эту смесь соответствующее количество кумазида, перемешивают в течение 15 мин и прессуют в таблетку.

Пример 8

Фармацевтическая композиция содержит кумазид в качестве активного вещества и наполнитель, состоящий из сорбита и стеарата кальция, при следующем соотношении компонентов, мг:

Кумазид 0,5Сорбит 45,0Стеарат кальция 5,0

Фармацевтическую композицию готовят, как в примере 7.

Пример 9. Изучение гемолитической и цитотоксической (эмбриотоксической) активностей.

Известно, что токсичность гликозидных препаратов из голотурий определяется в основном их гемолитическими свойствами, а именно чем выше их гемолитическая активность, тем большей токсичностью характеризуются эти препараты (Kalinin V.I. et. al. Hemolytic activity of triterpene glucosides from the Cucumariidae family holothurians and evolution of this group of toxins // J. Nat. Toxins. 1992. V.1, №2. Р.17-30).

Гемолитическую активность гликозидных препаратов определяли по известной методике [Thron C.D. Hemolysis by holothurin A, digitonin and quiiaia saponin: estimates of the requared cellular lysin uptakes and free lysin concentrations // J. Pharm. Exp. Therap. 1964. V.145, №2. Р.194-202; Segal R., Mansour M., Zaitschek D.V. Effect of ester groups on the haemolytic action of some saponins and sapogenins // Biochem. Pharmacol. 1966. V.15, №10. Р.1411-1416].

Для определения цитотоксичности (эмбриотоксичности) тестируемых препаратов в качестве клеточной модели использовали развивающиеся эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus nudus nudus [Бузников Г.А., Подмарев В.К. Морские ежи Strongylocentrotus drobachiensis, S.nudus, S.intermedius // В кн.: Объекты биологии развития. М.: Наука. 1975. С.188-216; Kobayashi N. Marine ecotoxicological testing with echinoderms // In: Ecotoxicological testing for the marine environment / Eds. Persoone G., Jaspers E., Claus C.: State Univ. Ghent and Inst. Mar. Scient. Res., Bredene, Belgium. 1984. V.1. P.798].

Исследования показали, что заявляемое средство и фармацевтическая композиция на его основе отличаются значительно меньшей гемолитической и цитотоксической (эмбриотоксической) активностями, чем известный препарат КД. Как следует из фиг.1А, кумазид показывает приблизительно в 20 раз меньшую гемолитическую активность, чем препарат КД (ГК50 около 50 мкг/мл для кумазида и около 2,5 мкг/мл для КД).

Независимо от используемого при образовании комплексов стерина наблюдали приблизительно одинаковое уменьшение цитотоксических свойств. Так, для кумазида, представляющего собой комплекс моносульфатированных кукумариозидов с ситостерином, наблюдалось существенное уменьшение эмбриотоксичности (ЭД50 для препарата КД равна 1,5 мкг/мл, а для кумазида 6,0 мкг/мл) (фиг.1 Б).

Пример 10. Исследование иммуномодулирующей активности.

I. Способы введения препаратов.

В тестах использовали лабораторных мышей линии BALB/c. Исследуемые препараты вводили однократно внутрибрюшинно по 0,5 мл в физиологическом растворе в различных концентрациях. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Через трое суток после введения препаратов мышей забивали, выделяли перитонеальные макрофаги по стандартной методике. Использовали не менее 5 животных в группе на 1 дозу препарата.

Кроме того, изучаемые препараты вводили перорально. Для этого использовали водные суспензии кумазида в различных концентрациях, которыми экспериментальных животных поили ежедневно. Через определенные промежутки времени (дни), в зависимости от цели эксперимента, мышей забивали и выделяли перитонеальные макрофаги по стандартной методике.

Для перорального применения на мышах использовались также таблетки. Действующая доза для мышей весом 20 г составляла 0,02 мкг на мышь. Кормление животных таблетками проводили ежедневно. Животных отбирали в определенные дни и исследовали лизосомальную активность перитонеальных макрофагов с помощью прижизненного флуоресцентного красителя акридиновый оранжевый и системы анализа изображения клеток.

II. Оценка лизосомальной активности мышиных перитонеальных макрофагов.

Оценку активности внутриклеточных лизосом проводили путем окрашивания и локализации лизосом флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым [Millot С., Millot J.M., Morjani H., Desplacad A., Montait M. Characterization of acidic vesicles in multidrug-resistant and sensitive cancer cells by acridine orange staining and confocal microspectrofluorometry // J. Histochem. Cytochem. 1997. V.45, №9. Р.1255-1264; Zoccarato F., Cavallini L., Alexandre A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes // J. Neurochem. 1999. V.72, №2. Р.625-633]. Измерение интенсивности флуоресценции клеток в монослое проводили модифицированным методом Лоу. Макрофаги получали из перитонеальной жидкости мышей линии BALB/c. Мышей забивали методом перивисцеральной дислокации, в брюшную полость немедленно вводили 1 мл фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ, рН 7.4) и интенсивно пальпировали брюшную полость в течение 1-2 мин. Затем с помощью шприца собирали перитонеальную жидкость и по 250 мкл этой жидкости наносили на покровные стекла микроскопа и оставляли на 1 час при 37°С в термостате. После адгезии макрофагов покровные стекла трижды промывали в ФСБ (рН 7.4) и на клеточный монослой наносили 250 мкл раствора акридинового оранжевого ("Calbiochem", 100 мкг/мл в фосфатном буферном растворе) и оставляли стекла в термостате при 37°С еще на 30 мин. После этого клеточный монослой трижды отмывали ФСБ и покровные стекла монтировали на предметном столе системы анализа изображения клеток, состоящей из инвертированного микроскопа "Axiovert 200" (Zeiss, Германия), источника возбуждения флуоресценции и монохроматора "Optoscan" (Cairn Research Ltd, Англия) и цифровой CCD видеокамеры "ORCA-ER" (Hamamatsu Photonics K.K., Япония).

Флуоресценцию акридинового оранжевого возбуждали при λ=489 нм. Набор светоделительных фильтров для ФИТЦ (флуоресцеин изотиоционат) был установлен для визуализации флуоресценции акридинового оранжевого в лизосомах. Захваченные видеокамерой изображения переносили в IBM-совместимый компьютер Pentium-IV с помощью специализированной платы видеозахвата Firewire (США) и сохраняли в компьютерном жестком диске в виде графических файлов. Интенсивность уровня флуоресценции лизосом была определена инструментальными средствами программы "AQM Advance 6" (Kinetic Imaging Ltd., Англия). Флуоресценция случайно выбранных изображений 100-150 клеток для каждой концентрации исследуемых соединений была измерена как средняя интенсивность серого цвета для каждой клетки и выражалась в пикселях.

Средние значения и стандартная ошибка эксперимента рассчитывались графически с помощью компьютерной программы "SigmaPlot 3.02" (Jandel Corporation, США).

Иммуномодулирующие свойства препаратов оценивали по повышению активности перитонеальных макрофагов. Как следует из фиг.2, кумазид в такой же степени стимулирует макрофагальную активность, как и КД, причем он активен как при пероральном применении, в том числе при поении животных водной суспензией или при применении кумазид-содержащих таблеток, так и при интраперитонеальной инъекции. Так, таблетки скармливали ежедневно мышам линии BALB/c, каждое животное получало приблизительно 0,02 мкг активной субстанции в день. Стимуляцию иммунной системы оценивали по активации макрофагов (фиг.3).

Исследования показали, что лизосомальный компартмент мышей резко активировался после 5-го дня с начала эксперимента и активация достигала максимума на 10-й день. В течение 4 недель с начала эксперимента макрофаги оставались в активированном состоянии, причем их активность в 3-4 раза превышала таковую в контрольном эксперименте.

После прекращения приема таблеток не наблюдали угнетения активности макрофагов (фиг.4). Так, при прекращении приема таблеток на 12-й день эксперимента у мышей наблюдалось медленное снижение активности макрофагов, но даже на 30-й день их активность оставалась более высокой, чем у контрольной группы.

Таким образом, заявляемое средство и фармацевтическая композиция на его основе при пероральном введении стимулировали клеточный иммунитет даже при использовании чрезвычайно низких доз (менее 0,1 мкг активной субстанции на животное), причем за стадией стимуляции не следовала стадия угнетения.

Пример 11. Исследование противоопухолевой активности.

I. Исследование противоопухолевой активности в экспериментах с асцитной формой мышиной карциномы Эрлиха.

Опыты проведены на белых беспородных мышах массой 20-21 г. Препарат суспендировали в стерильном физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно 1 раз (за 4 дня до прививки опухоли) или 2 раза (за 6 дней и 2 дня до прививки опухоли). Группе контрольных животных вводили по 0,5 мл физиологического раствора. Клетки асцитной карциномы Эрлиха (тетраплоидный штамм) вводили внутрибрюшинно в количестве 1,0-1,5×106 клеток/мышь. Противоопухолевый эффект оценивали по увеличению средней продолжительности жизни (УПЖ) мышей, которым вводили препарат, выраженной в процентах по отношению к контролю, и по общему числу опухолевых клеток в асцитической жидкости в пересчете на целое животное. В каждой подопытной группе было 7 животных.

Показано, что двукратное введение препарата в дозе 8,0 мкг/кг вызывает достоверное торможение роста опухоли карциномы Эрлиха порядка 27% по сравнению с контрольными животными на ранних стадиях развития опухоли. В таблице представлены данные по влиянию препарата кумазид на рост асцитной формы карциномы Эрлиха у мышей.

Таблица
Влияние препарата кумазид* на рост асцитной карциномы Эрлиха у мышей
ВоздействиеДоза, мкг/кгЧисло клеток/мышь** (1х107)Торможение роста опухоли, %Кумазид*8.076.0±1227.0Контроль-104.0±8-* Кумазид вводился дважды, за 6 и 2-е суток до трансплантации опухоли.
** Оценка на 6-е сутки после трансплантации опухоли. Вводили 1.0×106 кл/мышь. Данные представлены как m±se (n=7).

В то же время было отмечено, что начиная с 10 дня после инокуляции опухоли показатели объема асцитической жидкости и количества опухолевых клеток у контрольных животных и животных, получивших инъекцию препарата кумазид, выравнивались, а средняя продолжительность жизни у контрольных и опытных животных достоверно не различались.

II. Исследование противоопухолевой активности в экспериментах с солидной формой мышиной карциномы Эрлиха.

Опыты проводили на белых беспородных мышах массой 20-21 г. Препарат суспендировали в стерильном физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно дважды за 4 и за 1 день до инокуляции опухоли в дозе 0,2 мкг/мышь (10 мкг/кг) в объеме 0,5 мл. Группе контрольных животных вводили по 0,5 мл физиологического раствора. Клетки асцитной карциномы Эрлиха (тетраплоидный штамм) вводили подкожно под левую переднюю лапу в количестве 5×106 клеток/мышь. Противоопухолевый эффект оценивали по уменьшению объема солидной опухоли у мышей, которым вводили препарат, выраженный в см3. Регистрацию размеров солидной опухоли проводили через день, начиная с 6-го дня после инокуляции, методом томографии с использованием ЯМР-томографа для животных Pharmascan 70/16 US (Брукер, Германия). С этой целью животных анестезировали инъекцией ксилозана внутрибрюшинно (0,3 мл/кг, Spora, PRAHA). Т2-взвешенные изображения получали при следующих параметрах томографа: TR/TE, 3535,4/44ms; полем обзора 7,72 см; временем захвата 3,4 мин; размером матрицы 2562 см; толщиной среза 1 мм. Объем опухоли рассчитывался путем измерения геометрических параметров опухоли в серии слайдов из двух ортогональных изображений с помощью программных средств томографа ParaVision 3.0.1.

Показано (фиг.5), что кумазид при двукратной внутрибрюшинной инъекции в дозе 10 мкг/кг существенно, в 3,2 раза по сравнению с контролем, тормозит развитие солидной формы мышиной карциномы Эрлиха на ранней стадии развития опухоли, оцененной на 6-й день после инокуляции.

Похожие патенты RU2271820C1

название год авторы номер документа
СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 2009
  • Аминин Дмитрий Львович
  • Сильченко Александра Сергеевна
  • Авилов Сергей Анатольевич
  • Калинин Владимир Иванович
  • Стоник Валентин Аронович
RU2415863C1
СПОСОБ ПЕРЕРАБОТКИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЙ КУКУМАРИИ Cucumaria japonica И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРОДУКТ, ПОЛУЧАЕМЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ 2009
  • Стоник Валентин Аронович
  • Агафонова Ирина Григорьевна
  • Аминин Дмитрий Львович
  • Антонов Александр Сергеевич
  • Иващенко Вера Федоровна
  • Макарьева Татьяна Николаевна
  • Ребачук Николай Михайлович
RU2426453C1
СРЕДСТВО, ИНГИБИРУЮЩЕЕ МНОЖЕСТВЕННУЮ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК 2012
  • Менчинская Екатерина Сергеевна
  • Аминин Дмитрий Львович
  • Сильченко Александра Сергеевна
  • Андриященко Пелагея Владимировна
  • Авилов Сергей Анатольевич
  • Калинин Владимир Иванович
  • Стоник Валентин Аронович
RU2494742C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЯ АНТИГЕНОВ НА ОСНОВЕ ЛИПИДОВ ИЗ МОРСКИХ МАКРОФИТОВ И ТРИТЕРПЕНОВОГО ГЛИКОЗИДА КУКУМАРИОЗИДА 2005
  • Санина Нина Михайловна
  • Попов Александр Михайлович
  • Ли Ирина Арсентьевна
  • Костецкий Эдуард Яковлевич
  • Цыбульский Александр Васильевич
  • Шныров Валерий Леонидович
RU2319506C2
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2001
  • Ковалевская А.М.
  • Стоник В.А.
  • Гришин Ю.И.
RU2184556C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРОНДОЗИДА А И СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 2005
  • Авилов Сергей Анатольевич
  • Калинин Владимир Иванович
  • Сильченко Александра Сергеевна
  • Аминин Дмитрий Львович
  • Агафонова Ирина Григорьевна
  • Стоник Валентин Аронович
  • Коллин Питер Д.
  • Вудворд Карл
RU2339644C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУММЫ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ (ВАРИАНТЫ) 1996
  • Стоник В.А.
  • Авилов С.А.
  • Федоров С.Н.
  • Богуславский В.М.
RU2110522C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ФОРМ ГЛИКОЗИДОВ В ПРЕПАРАТАХ ИЗ ГОЛОТУРИЙ 2009
  • Калиновский Анатолий Иванович
  • Стоник Валентин Аронович
RU2410673C1
НОСИТЕЛЬ АНТИГЕНОВ 2006
  • Попов Александр Михайлович
  • Ли Ирина Арсентьевна
  • Костецкий Эдуард Яковлевич
  • Санина Нина Михайловна
  • Цыбульский Александр Васильевич
  • Шныров Валерий Леонидович
  • Мазейка Андрей Николаевич
RU2322259C1
СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ВНУТРЕННОСТЕЙ ГОЛОТУРИЙ С ПОЛУЧЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ "ТИНГОЛ-2" И "ЭРОГОЛ" 2001
  • Слуцкая Т.Н.
  • Тимчишина Г.Н.
  • Павель К.Г.
RU2215532C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 271 820 C1

Реферат патента 2006 года ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО "КУМАЗИД" И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию иммуномодулирующих средств и фармацевтических композиций на их основе. Иммуномодулирующее средство представляет собой комплекс моносульфатированных кукумариозидов со стерином, при молярном соотношении кукумариозиды:стерин 1:2, полученный при добавлении к экстракту кукумарии японской Cucumaria japonica или к экстракту выварочных вод - отходов при переработке кукумарии японской или к раствору суммы кукумариозидов раствора стерина. В качестве раствора стерина используют раствор холестерина или раствор ситостерина. Фармацевтическая композиция, обладающая иммуномодулирующей активностью, содержит вышеназванное средство и наполнитель при определенном соотношении компонентов. Фармацевтическая композиция может быть использована для профилактики развития опухоли на ранних стадиях. Средство и композиция на его основе не токсичны. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Формула изобретения RU 2 271 820 C1

1. Иммуномодулирующее средство, характеризующееся тем, что оно представляет собой комплекс моносульфатированных кукумариозидов со стерином при молярном соотношении кукумариозиды:стерин 1:2, полученный при добавлении к экстракту кукумарии японской Cucumaria japonica, или к экстракту выварочных вод - отходов при переработке кукумарии японской, или к раствору суммы кукумариозидов раствора стерина.2. Средство по п.1, где в качестве раствора стерина используют раствор холестерина или раствор ситостерина.3. Фармацевтическая композиция, обладающая иммуномодулирующей активностью, характеризующаяся тем, что она содержит средство по п.1 и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Средство по п.1 0,1-1,0НаполнительОстальное

4. Фармацевтическая композиция по п.3 может быть использована для профилактики развития опухоли на ранних стадиях.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2006 года RU2271820C1

Способ изготовления изоляционной ленты 1926
  • Каменский Ф.А.
SU8064A1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2001
  • Ковалевская А.М.
  • Стоник В.А.
  • Гришин Ю.И.
RU2184556C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУММЫ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ (ВАРИАНТЫ) 1996
  • Стоник В.А.
  • Авилов С.А.
  • Федоров С.Н.
  • Богуславский В.М.
RU2110522C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК 1990
  • Гришин Ю.И.
  • Ковалевская А.М.
  • Стоник В.А.
  • Авилов С.А.
  • Влазнев В.П.
  • Слугин В.С.
RU2036654C1

RU 2 271 820 C1

Авторы

Стоник Валентин Аронович

Аминин Дмитрий Львович

Богуславский Валентин Михайлович

Авилов Сергей Анатольевич

Агафонова Ирина Григорьевна

Сильченко Александра Сергеевна

Пономаренко Людмила Петровна

Прокофьева Нина Григорьевна

Чайкина Елена Леонидовна

Даты

2006-03-20Публикация

2004-07-02Подача