СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЗАН-КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах.

Фенозан-кислота (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенилпропионовая кислота) является синтетическим антиоксидантом и изучается в качестве потенциального лекарственного препарата [Трещенкова Ю.А., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты: Тез. докл. V Межд. конф. - М., 1998, С.182-183].

Известен способ количественного определения соединений, относящихся к пространственно-затрудненным фенолам, хемилюминесцентным методом путем регистрации изменения интенсивности хемилюминесценции модельной цепной реакции инициированного окисления углеводородов после введения в систему антиоксиданта [Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Хемилюминесцентный метод изучения природных антиоксидантов в липидах. // Биофизика. - 1971 - №1.- С.39-43].

Однако данный способ не может быть использован для определения фенозан-кислоты в биологических объектах, поскольку невозможно с необходимой достоверностью предварительно определить общее базисное содержание эндогенных антиоксидантов у каждого животного.

Задачей изобретения является обеспечение возможности количественного определения фенозан-кислоты в сложном многокомпонентном биологическом материале.

Это достигается за счет того, что анализируемую пробу биожидкости после подкисления до рН=1 обрабатывают органическим экстрагентом для извлечения фенозан-кислоты, после чего переводят ее в метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.

Подкисление анализируемой пробы биожидкости до рН=1 необходимо для того, чтобы полностью подавить ионизацию фенозан-кислоты и тем самым обеспечить полный переход ее в органическую фазу в процессе экстракции. Перевод фенозан-кислоты в ее метиловый эфир осуществляется для того, чтобы повысить летучесть определяемого вещества. Предлагаемый температурный режим газожидкостного хроматографирования аналита необходим потому, что именно в этих условиях происходит удовлетворительное разделение пиков фенозан-кислоты, внутреннего стандарта и эндогенных соединений.

Способ осуществляют следующим образом.

К сухому остатку после эфирной экстракции биожидкости добавляют раствор диазометана. После завершения дериватизации эфир удаляют и к сухому остатку прибавляют хроматографически чистый внутренний стандарт, представляющий собой раствор додекана, например, в метаноле с концентрацией 15 нг/мкл. Пробу полученного раствора сразу же вводят в хромато-масс-спектрометр (например, газовый хроматограф HP 5980 серия II, масс-селективный детектор HP 5971 А и станция обработки данных HP 59970 С).

Пробу анализируют при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.

Пример. Количественное определение фенозан-кислоты в плазме крови кроликов (модельные растворы). Раствор "стандартной плазмы" готовят из лиофилизированной сухой плазмы добавлением соответствующего количества дистиллированной воды, перемешивания, настаивания, фильтрации. Основной стандартный раствор фенозан-кислоты концентрации 1 мг/мл готовят растворением точно взвешенного количества воздушно-сухого вещества в метаноле. Растворы-метчики получают разведением основного раствора: концентрация метчика от 10 до 1000 мкг/мл в соответствии с данными табл.1. 100 мкл каждого метчика добавляют к 1 мл плазмы для приготовления калибровочных растворов фенозан-кислоты с содержанием от 1 до 100 мкг/мл (С_плазмы). Для каждого значения концентрации готовят три раствора. "Нулевой" раствор содержит 100 мкл чистого метанола в плазме. После введения метчика растворы в плазме выдерживают не менее 1 ч при 20°С для установления равновесия.

Фенозан-кислоту из калибровочных растворов и из биожидкостей выделяют экстракцией эфиром после подкисления растворов до рН=1, эфирные экстракты упаривают в токе воздуха при 40°С. К сухим экстрактам добавляют по 1 мл эфирного раствора диазометана, смеси оставляют на 12 ч. После завершения дериватизации эфир удаляют в токе воздуха, к высушенному остатку приливают от 50 до 200 мкл раствора внутреннего стандарта, а затем 0,6-1,0 мкл полученного раствора сразу же вводят в хроматограф (С_гх).

Воспроизводимость хромато-масс-спектрометрического определения оценивали по стандартному раствору С_гх, содержащему 12,5 нг/мкл метилового эфира фенозан-кислоты (концентрация хроматографируемого раствора С_гх) и 10 нг/мкл внутреннего стандарта, при числе повторностей, равном 7: ; S=1,52; S_r=0,09; ε=1,4; доверительный интервал 16,5±1,4; W=9,2%.

Воспроизводимость методики оценивали по стандартному раствору 4 мкг/мл фенозан-кислоты в плазме (С_пл) при числе повторностей, равном 7: ; S=1,85; S_r=0,19; ε=1,7; доверительный интервал 9,8±1,7; W=17%. Здесь W - коэффициент вариации, S - среднее квадратичное отклонение, , , где t_α - коэффициент Стьюдента при n=7, α=0,95.

В табл.2 приведены результаты калибровки. Объединенное уравнение регрессии для интервала концентраций 0,5-100 мкг/мл имеет вид: С_пл=0,245Q+1,515 мкг/мл, коэффициент линейной регрессии r=0,998. Для интервала концентраций 0,5-0,01 мкг/мл: С_пл=0,097Q-0,0051 мкг/мл, коэффициент линейной регрессии r=0,989.

Для оценки методики в целом независимо приготовленный раствор - стандартный образец фенозан-кислоты в плазме концентрации 4 мкг/мл - был проанализирован среди серии калибровочных растворов. В табл.3 приведены значения определенных по калибровочному графику и рассчитанных концентраций фенозан-кислоты, .

Стандартная статистическая обработка полученных результатов показала их достоверность и высокую воспроизводимость для α=0,95, максимальное единичное отклонение средней величины от истинной концентрации составляет 18%, отклонение, рассчитанное для средней величины ΔС, составляет 2%.

Из табл.3 видно, что предлагаемый способ количественного определения фенозан-кислоты в биологических объектах методом хромато-масс-спектрометрии обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью, он позволяет надежно и достоверно определять в биологическом материале количественное содержание фенозан-кислоты в различные интервалы времени после его введения.

Разработанный способ может быть использован для количественного определения фенозан-кислоты в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата.

Таблица 1Приготовление калибровочных растворов фенозан-кислоты в плазме крови.     АВС№C_исх мг/млV_исх млV_общ мл (МеОН)C_{метчика} мкг/млC_плазмы мкг/млC_гх, нг/мклm (метиловый эфир фенозан-кислоты) нг      200 мкл25 мкл200 мкл25 мкл11--1000100500300213,5570070350210312,5550050250150411,052002010060510,55100105030610,2555052515710,10520210680,1 мкг/мл0,551015390,1 мкг/мл0,25550,52,5201,512100,01 мкг/мл0,551,00,10,540,32,4110,01 мкг/мл0,2550,50,050,2520,151,2120,001 мкг/мл0,550,10,010,050,40,030,24А - из расчета объем метчика 100 мкл, объем плазмы 1 мл.В - из расчета объем реконструирующего раствора 200 мкл и 25 мкл.С - из расчета объема пробы, вводимой в хроматограф, равной 0,6 мкл.

Таблица 2Результаты анализа калибровочных растворов фенозан-кислоты в плазме крови.№С_пл, мкг/млC_гх мкг/млQ₁Q₂О₃1100500338340351270350238242242,7350250170,7168,319042010058,551,856,45105031,1239,331,6652512,410,0213,672104,444,522,66Таблица 3Оценка точности методики анализа фенозан-кислоты в плазме крови.№QSΔС113,1574,74 0,83 0,7418,528,933,70 0,21 0,307,539,573,86 0,05 0,143,549,803,923,910,010,4550,082,057,443,34 0,57 0,6616,568,563,61 0,30 0,399,75711,014,21 0,30 0,215,25

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах. Предлагается способ количественного определения фенозан-кислоты в сложном многокомпонентном биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемую пробу биожидкости (кровь, моча) после подкисления до рН=1 обрабатывают для извлечения определяемого вещества органическим экстрагентом. Фенозан-кислоту, содержащуюся в сухом остатке после упаривания экстракта, с целью увеличения летучести переводят в ее метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, используемого в качестве внутреннего стандарта. Полученный раствор анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальная температура колонки 75°С поддерживается без изменения 2 мин после ввода пробы, далее увеличивается до 280°С со скоростью 50 град/мин и поддерживается постоянной до конца программы. Концентрацию фенозан-кислоты определяют по предварительно построенному калибровочному графику. Технический результат: обеспечение возможности количественного определения фенозан-кислоты в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата, возможность его использования при выполнении клинических или фармакокинетических исследований препарата, а также при изучении его метаболизма. 3 табл.

Способ количественного определения фенозан-кислоты, 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенилпропионовой кислоты в биологических жидкостях, характеризующийся тем, что анализируемую пробу биожидкости после подкисления до рН=1 обрабатывают органическим экстрагентом для извлечения фенозан-кислоты, после чего переводят ее в метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.