СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА В ТКАНЯХ ГИДРОБИОНТОВ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/12 

Изобретение относится к биохимии, в частности к электрохимическому способу определения α-токоферола, в частности, в осетровых.

Известен способ определения токоферола с применением хроматографических методов очистки. Способ заключается в щелочном омылении образцов, экстракции неомыляемой части, разделении методом тонкослойной хроматографии, проведении цветной реакции непосредственно на пластине, элюировании цветного комплекса с пластинки и фотометрировании элюата [1] Недостатками данного метода являются многоэтапность, косвенность и, как следствие, низкая точность определения.

Наиболее близким по сути является способ количественного определения в галеновых формах антиоксидантов методом жидкостной хроматографии: УФ- и электрохимическое детектирование [2]
Для количественного определения в галеновых формах антиоксидантов предложено использовать метод жидкостной хроматографии на колонке Resolve 5 мкм Spherical C осуществляется на хроматографе Waters, снабженных УФ- и электрохимическим детектором. Рабочий электрод пиролитический стекловидный углерод, электрод сравнения Ag/AgCl (KCl/насыщенный AgCl). Возможности метода продемонстрированы при анализе таблеток ацетата a-токоферола, содержащих антоцианозиды различных ветеринарных мазей и растворов. Каждый образец анализируют методом изократического алюирования, используя в качестве элюата смесь (35 65) вода: MeOH pH 5,5 и 10 М LiClO₄. Величину pH устанавливают введением 0,1 р-ра HCl. При анализе консервантов получаются значения концентраций, которые равны или ниже истинных; точность определения составляет 5. Коэффициент вариабельности низок.

Однако названный способ имеет следующие недостатки.

Метод определения косвенный, включает в себя несколько этапов, и как следствие достаточно продолжительный по времени.

Сложность оборудования, требующего для обслуживания специалиста и оборудованного места установки.

Достаточно высокий процент ошибки определения.

Сравнительно большой расход реактивов.

Целью изобретения является повышение точности определения содержания токоферола в объектах, уменьшение количества стадий предварительной подготовки и сокращение времени анализа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе осуществляют электрохимическое определение токоферола методом циклической вольтамперометрии. Данный метод основывается на способности токоферолов к 1-электронному окислению и реализуется с помощью системы для электрохимических измерений, состоящей из программатора ПР-8, потенциостата ПИ-50 и прибора двухкоординатного регистрирующего ПДА-1.

Предлагаемый способ определения токоферола реализовали следующим образом. Перед началом непосредственно эксперимента получали жировую вытяжку из пробы. Гонады осетровых гомогенизировали и собирали выделившуюся жировую фракцию. Ткани с меньшим содержанием жира мышцы, печень и т.д. гомогенизируют с безводным сульфатом натрия в соотношении рыбы и соли 1 2. Затем пробу заливали растворителем и настаивали при периодическом встряхивании 20 30 минут. В качестве растворителя использовали хлороформ или хлористый метилен. Далее для получения чистой жировой фракции хлороформ выпаривали на водяной бане, а экстракт жира в хлористом метолене использовался для определения непосредственно без выпаривания.

Измерения вели в электрохимической ячейке, сопряженной с системой для электрохимических измерений. Рабочий объем ячейки 3 мл. В качестве рабочего электрода использовали платиновый стационарный дисковый электрод (d 2 мм). Электрод сравнения хлорсеребряный с водонепроницаемой диафрагмой. Вспомогательный электрод платиновая спираль. Так как электрохимические измерения проводились в неводных средах, предусматривалась аналоговая компенсация омических потерь с помощью потенциостата ПИ-50.

В ячейку помещали смесь растворителей ацетонитрила и хлористого метилена. Хлористый метилен обеспечивает растворимость жировой фракции, а ацетонитрил повышает электропроводность раствора. Соотношение ацетонитрила и хлористого метилена 1 1 обеспечивает максимальную электропроводность раствора при любых концентрациях жировой фракции. Далее в ячейку добавляли фоновый электролит перхлорат тетрабутиламмония в концентрации 0,1 моль/л, определенное количество жировой фракции и снимали циклическую вольтамперограмму. Определяли максимальный ток анодного пика окисления токоферола и по калибровочному графику находили содержание токоферола в объекте. Калибровочный график строили по аптечным растворам токоферола с заранее известной концентрацией (см. таблицу). Точность определения составляет 0,1.

Использование предлагаемого способа определения токоферола обеспечивает по сравнению с существующими следующие преимущества: малый расход реактивов, экспрессность и высокоточность метода, простота используемого оборудования и возможность его эксплуатации в экспедиционных условиях.

Пример. Для количественного определения токоферола брали 10 г печени осетра, гомогенизировали с 20 г безводного сульфата натрия, заливали хлористым метиленом и настаивали в герметично закрытом сосуде 30 мин. Затем 1,5 мл экстракта переносят в ячейку, добавляют 1,5 мл ацетонитрила и 1,5 микрошпателя (концентрация 0,1 моль/л) перхлората тетрабутиламмония, перемешивают до растворения фона. Снимают ЦВА, определяют максимальный ток пика окисления и по калибровочному графику содержание токоферола.

Источники информации
1. Ulberth Franz, J. High. Одновременное определение изомеров витамина E и холестерина методом газожидкостной хроматографии //Resolut Chromatograf, 1991, 14, N5, p. 343 344.

2. Grosset C. Cantin P. Alarys. Количественное определение в галеновых формах антиоксидантов методом жидкостной хроматографии. //Analusis, 1989, 17, N 7, p. 409 412.

Использование: изобретение относится к биохимии, в частности к электрохимическому способу определения α-токоферола в тканях гидробионтов, преимущественно осетровых рыб. Сущность изобретения: сырье подвергают экстракции хлористым метиленом или хлороформом для извлечения жировой фракции, а определение α-токоферола в последней осуществляют электрохимическим методом в присутствии ацетонитрила и хлористого метилена, при этом снимают циклическую вольтамперограмму, определяют максимальный ток анодного пика окисления α-токоферола и по калибровочному графику находят содержание последнего. Предлагаемое изобретение обеспечивает малый расход реактивов, экспрессивность и высокоточность определения, простоту используемого оборудования и возможность его использования в экспедиционных условиях. 1 табл.

Способ количественного определения α-токоферола в тканях гидробионтов путем экстракции сырья, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют хлористым метиленом или хлороформом для извлечения жировой фракции, а определение α-токоферола в последней осуществляют электрохимическим методом в присутствии ацетонитрила и хлористого метилена, при этом снимают циклическую вольтамперограмму, определяют максимальный ток пика окисления α-токоферола и о содержании последнего судят по калибровочному графику зависимости количества α-токоферола от максимального тока.