СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АКТИВНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН Российский патент 2006 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, конкретно к способам серологической диагностики активной хламидийной инфекции у беременных методом иммуноферментного анализа.

Известен способ диагностики активности хламидиоза методом иммуноферментного анализа, основанный на обнаружении в сыворотке крови антител IgM и IgG к родоспецифическому липополисахаридному антигену (LPS-антиген) [1]. Наличие LPS характерно также для состава наружной мембраны грамм-отрицательных бактерий [2]. Это объясняет низкую специфичность этого способа при обследовании на инфекцию, вызванную Chlamydia trachomatis, и малая информативность в диагностике активного процесса.

В настоящее время применяется способ ИФА диагностики активной хламидийной инфекции, основанный на обнаружении в сыворотке крови антител IgM к рекомбинантному белку МОМР Chlamydia trachomatis [3].

МОМР - главный (основной) белок наружной мембраны, встречается у всех представителей Chlamydia trachomatis, составляет 60% от всех поверхностных белков микроорганизма, несет на себе также функцию порина, обеспечивает жесткость оболочки элементарного тельца хламидии. Антитела против МОМР подавляют антилизосомальную активность хламидии при внутриклеточном паразитизме. Наиболее часто в сыворотке определяются антитела к главному белку наружной мембраны. Как самый иммуногенный, МОМР является основой для создания диагностических иммуноферментных тестов. Однако IgM дают перекрестную реакцию с изогемагглютининами (анти А, анти В), ревматоидным фактором, холодовыми агглютининами. Уровень IgM повышается при коллагенозах, энтеропатии, паразитарных заболеваниях, при наличии холодовых агглютининов [4]. Во время беременности отмечается нарушение механизма переключения синтеза IgM на IgG, что может проявляться снижением уровня IgM и IgA. Гуморальный иммунитет претерпевает фазность: повышен в ранние сроки и снижен в более поздние сроки беременности. Все эти особенности затрудняют диагностику активной хламидийной инфекции во время беременности, тем самым, приводя к ошибкам в лечебной тактике.

Новая техническая задача - повышение точности способа.

Поставленную задачу решают новым способом диагностики активной хламидийной инфекции у беременных путем определения антител Chlamydia trachomatis в сыворотке крови, причем определяют антитела IgG к рекомбинантному белку Pgp3 Chlamydia trachomatis и при их обнаружении диагностируют активную хламидийную инфекцию у беременных.

Pgp3 - мембран-ассоциированный белок, кодируемый общей плазмидой Chlamydia trachomatis, которая присутствует в большинстве штаммов и клинических изолятов. Высокая экспрессия плазмидной ДНК характерна лишь для фазы активной вегетации [5]. Будучи антиген-значимым для иммунной системы, этот белок может быть использован для серодиагностики хламидийных заболеваний. Антитела к нему были обнаружены у детей и взрослых с генитальной и глазной хламидийной инфекцией. В контрольной группе здоровых доноров антител к pgp3 обнаружено не было [6].

Способ осуществляют следующим образом.

Используемый в данном случае вариант ИФА относится к неконкурентному ИФА для определения антител в исследуемом образце при помощи ферментмеченного антиглобулина.

Рекомбинантный антиген pgp3 С.trachomatis L2, клонируют в Е. Coli-p1248, вектором pEV40 (производство Invitrogen, San Diego, Calif.). Затем белок очищают аффинной хроматографией с использованием Ni 2+ хроматографической колонки. Чистоту полученного белка анализируют в SDS-полиакриламидном геле (12,5%), используя окрашивание Coomassie blue (Sigma). Чистота составляла 95-98%. Полученный белок хранят в буфере (8М мочевина, 10 mM Tris, (β-mercatoethanol) при 2-10°С.

Сорбцию рекомбинантного белка осуществляют на микропланшеты PolySorb (Nunc, Denmark), по 100 μl в лунку при концентрации белка - 0,5-2 мкг/мл, в 0,05М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (КББ) (рН 9,6). Инкубируют при 2-10°С в течение 16 ч. Блокировку осуществляют 1% БСА (бычий сывороточный альбумин, Sigma) и 3% сахарозой (Sigma) при комнатной температуре (20-25°С), 1 час, по 150 μl в лунку. После сушки плашки промывают однократно, в течение 5 минут, фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) (рН 7,4), содержащим 0,05% Tween 20 (PBS-T). Сыворотку для исследования получают по стандартной методике. Проводят забор 5 мл венозной крови из локтевой вены натощак. Исследуемые сыворотки вносят по 100 μl в лунку, в разведении 1:20. Затем после 30 минутной инкубации при 37°С, осуществляют промывку 5 раз PBS-Т. Связавшиеся специфические комплексы IgG к pgp3 выявляют моноклональным конъюгатом против IgG человека (Bio-Rad, Calif.) в разведении 1:10000. После 30 минутной инкубации, микропланшеты промывают 5-кратно PBS-T. Окрашивание окончательного продукта реакции осуществляют тетраметилбензидином (Sigma) по инструкции производителя. Цветную реакцию останавливают добавлением 50 μl 1М H₂SO₄, после 30 минутной инкубации при комнатной температуре, в темноте. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре TECAN на 450 нм. И при обнаружении антител IgG к рекомбинантному белку Pgp3 Clamydia trachomatis диагностируют активную хламидийную инфекцию.

Pgp3 - мембран-ассоциированный белок, кодируемый общей плазмидой Chlamydia trachomatis, которая присутствует в большинстве штаммов и клинических изолятов. Высокая экспрессия плазмидной ДНК характерна лишь для фазы активной вегетации [5]. Будучи антиген-значимым для иммунной системы этот белок может быть использован для серодиагностики хламидийных заболеваний. Антитела к нему были обнаружены у детей и взрослых с генитальной и глазной хламидийной инфекцией. В контрольной группе здоровых доноров антител к pgp3 обнаружено не было [6].

Под наблюдением находились 37 беременных женщин с подтвержденным диагнозом урогенитальный хламидиоз во время беременности методом ПЦР ("АмплиСенс Chlamydia trachomatis" НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва).

Сыворотки материнской и пуповинной крови, взятой в родах, были исследованы методом ИФА на хламидийные белки МОМР и pgp3. Положительный результат только на IgG к pgp3 зарегистрирован в 9 материнских сывороток и парных им образцов пуповинной крови (группа 1). Отрицательный результат дали 28 пар сывороток мать/плод (группа 2).

При изучении экстрагенитального анамнеза заболеваемости в группе с положительным результатом pgp3 отмечена тенденция к увеличению частоты атопических проявлений (дерматит), ВСД по кардиальному типу. Подобная тенденция наблюдается и в отношении болезней легких, таких как хронические бронхит и пневмония, хотя размеры выборки не позволяют говорить о статистически значимых различиях между группами. Достоверно можно говорить только о значительном повышении уровня урогенитальной патологии в первой группе (Таблица 1).

Для пациенток с наличием антител к pgp3 в сыворотке крови характерны следующие особенности. Это беременные с хроническим пиелонефритом и заболеваниями легких в анамнезе. Воспалительные заболевания органов малого таза и послеабортные эндометриты в анамнезе можно расценивать как клинические проявления хронической урогенитальной инфекции хламидийной этиологии.

Беременность у женщин из группы pgp3+ осложняется, как правило, гестозом с ранним началом, угрозой прерывания в первом триместре, обострениями пиелонефрита и частыми кольпитами, что также говорит об обострении этой хронической инфекции. Для них характерна низкая плацентация и плацентарная недостаточность, что объясняется изменениями в эндометрии вследствие перенесенного ранее эндометрита или внутриматочного инфицирования в ранние сроки настоящей беременности (Таблица 2). В испытуемой группе, как правило, развивалась субинволюция матки. В отсутствие аномилий родовой деятельности крупного плода можно предположить инфекционно-воспалительную этиологию этого осложнения и объяснить отсутствие эндометрита лишь проведением полноценной антибактериальной терапии (Таблица 3). Также свидетельством активной инфекции может служить и сравнительно высокий уровень инфекционных осложнений у новорожденных из группы pgp3+ (Таблица 4).

Преимущества предлагаемого способа заключаются в повышении точности и информативности при диагностике хламидийной инфекции. Обнаружение анти-pgp3 антител дает возможность определить стадию инфекционного процесса, что позволит выбрать оптимальную лечебную тактику. Данный способ может быть рекомендован для применения в акушерской практике для прогнозирования осложнений беременности, послеродового периода и заболеваемости новорожденных хламидийной этиологии.

Источники информации

1. Brade L., S.Schramek, U.Schade, H.Brade Chemical, biological and immunochemical properties of the Chlamidia psittaci lipopolysaccharide // Inf. And. Immun. 1986. nov. P.568-740

2. Nurminen M., M.Leinonen, P.Saikku, R.H.Mäkelä The genus-specific antigen of Chlamydia: resemblance to the lipopolysaccharide of enteric bacteria // Nature. 17 June 1983.

3. Ossewaarde J.M, J.W.Manten, A.C.Hekker. An enzyme immunoassay to detect specific antibodue to protein and lipopolysaccharide antigens of Chlamydia trachomatis // J. of Immunol. Methods. 1989. 123. P.293-300.

4. Фримель X., Й. Брок. Основы иммунологии // M.: "Мир". 1986.

5. Bas S., Muzzin P., Ninet В., Bornand J.E., Scieux C., Vischer T.L.. Chlamydial serology: comparative diagnostic value of immunoblotting, microimmunifluorescence test, and immunoassays using different recombinant proteins as antigens // Journal of Clinical Microbiology. 2001. Vol.39. №4. P.1368-1377.

6. Bas S., Muzzin P., Ninet B. et al. Chlamydia trachomatis serology: diagnostic value of O uter Membrane Protein 2 compared with that of other antigens // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol.39. - P.4082-4085.

Таблица 1
АНАМНЕСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОБСЛЕДОВАННЫХ ГРУПП Частота заболеваемости в группах (%)Корелляционный анализЗаболеваемостьгруппа I n=9группа II n=28r_sPIАтопия22,20%12,50%0,260,13Хронические заболевания легких22,20%4,20%0,410,01Эндокринная патология33,30%37,50%0,090,6Сердечно-сосудистые заболевания22,20%8,30%0,330,06Болезни почек66,70%8,30%0,660,00002Воспалительные заболевания органов малого таза77,80%58,30%0,280,1Невынашивание22,20%12,50%0,20,26Послеабортный эндометрит33,30%4,20%0,50,003Примечания:
rs - коэффициент ранговой корреляции Спирмена между положительным анализом на pgp3 и наличием данного заболевания в анамнезе. Критическое значение коэффициента Спирмена при уровне значимости (α) 0,05 для выборки n=37 равно 0,325.
PI - достоверность корреляции.

Таблица 2
ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ Частота осложнений в группах (%)Корелляционный анализПатологиягруппа I n=9группа II n=28r_sPIГестоз88,80%33,33%0,540,001Гестационный пиелонефрит11,10%4,70%0,320,06Кольпит55,50%41,60%0,210,24Угроза прерывания в первом триместре44,40%29,17%-0,020,89Анемия77,70%66,67%0,230,18Внутриутробная гипоксия плода55,50%41,60%0,30,09

Таблица 3
ОСОБЕННОСТИ РОДОВ И ПОСЛЕРОДОВОГО ПЕРИОДА Частота осложнений в группах(%)Корелляционный анализПатологиягруппа I n=9группа II n=28r_sPIДородовое излитие вод66,60%45,83%0,280,1Слабость родовых сил22,20%33,30%0,380,82Гипоксия плода в родах78%79,17%0,130,45Плотное прикрепление последа22,20%4%0,410,01Фибрилитет в родах11,10%8,30%0,230,19Субинволюция матки33,30%12,50%0,360,04

Таблица 4
ОСЛОЖНЕНИЯ РАННЕГО НЕОНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДА Частота осложнений в группах (%)Корелляционный анализПатологиягруппа I n=9группа II n=28r_sPIППЦНС11,10%17,86%0,0820,62ЗВУР I степени010,71%0,050,74ЗВУР II-III степени07,14%0,110,49длительная желтуха22,20%42,86%-0,040,79церебральная ишемия55,50%50,00%0,150,34инфекции кожи и слизистых33,30%25,93%0,190,26

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для диагностики активной хламидийной инфекции у беременных женщин. Сущность изобретения состоит в том, что в сыворотке крови определяют антитела IgG к рекомбинантному белку Pgp3 Chlamydia trachomatis и при их обнаружении диагностируют активную хламидийную инфекцию. Техническим результатом является повышение точности диагностики активной хламидийной инфекции у беременных женщин. 4 табл.

Способ серологической диагностики активной хламидийной инфекции у беременных путем определения антител к Chlamydia trachomatis в сыворотке крови, отличающийся тем, что определяют антитела IgG к рекомбинантному, белку Pgp3 Chlamydia trachomatis и при их обнаружении диагностируют активную хламидийную инфекцию у беременных.