СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИХЛАМИДИЙНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 

Область применения: Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике.

Уровень техники

Аналогами данного изобретения являются описанные в отечественной и зарубежной литературе методы оценки функциональной активности специфических антител к инфекционным агентам (Коровина Н.А. и соавт., 1999; Кулаков А.В. и соавт., 1997; Мерингова Л.Ф. и соавт., 1997; Blackburn N.K. et al., 1991; Bodeus M. et al., 1998; Luxton R.W. et al., 1990; Климова С.В. и соавт., 1997), которые по ряду общих признаков могут быть подразделены на две группы:

1. Оценка функциональной активности антител с использованием константы диссоциации (Кулаков А.В. и соавт., 1997; Мерингова Л.Ф. и соавт., 1997).

2. Определение авидности (функциональной аффинности) антител с учетом индекса авидности (Коровина Н.А. и соавт., 1999; Blackburn N.K. et al., 1991; Bodeus M. et al., 1998) и с использованием формулы для определения относительной величины функциональной аффинности (Luxton R.W. et al., 1990; Климова С.В. и соавт., 1997).

Общим признаком методов первой группы является использование константы равновесия как меры аффинитета изучаемого взаимодействия. Наличие информации о точной концентрации антигена, антигенных детерминант позволяет с высокой точностью определять значение константы по тангенсу угла наклона прямой, построенной в координантных осях. Недостатками данных методов исследования являются трудоемкость и длительность их выполнения, использование дополнительных материалов (растворы антигена).

Наибольшего распространения в практической иммунологии получила вторая группа методов исследования, характеризующаяся быстротой исполнения, минимальными затратами на дополнительные реагенты и дешевизной исследований. Основой данных методов исследования является использование растворов детергентов с известной концентрацией, которые обладают способностью разрывать образовавшиеся связи в комплексе антиген-антитело. Учет результатов проводят с помощью индекса авидности, который отражает процент аффинных антител, или с помощью формулы, по которой расчитывают величину относительной аффинности. Индекс авидности антител, в частности, к цитомегаловирусу позволяет дифференцировать острую и хроническую инфекцию (Blackburn N.K. et al., 1991), исход беременности (Bodeus M. et al., 1998), внутриутробное и постнатальное инфицирование (Коровина Н.А. и соавт., 1999). Однако вышеназванные методы не дают информации о величине функциональной активности аффинных антител к слабым иммуногенам, в частности к хламидиям.

Прототипом предложенного способа является метод Matikainen M.T., Lehtonen O.P. (1984). Сущность метода заключается в определении аффинности антихламидийных антител в супернатанте культуры клеток и асцидной жидкости с использованием растворов известной концентрации антигена в условиях избытка специфических антител с помощью иммунноферментного анализа. Аффинность антихламидийных антител оценивают, используя процедуру подбора экстраполированной кривой, построенной в координантных осях. Недостатками данного метода исследования являются трудоемкость и длительность выполнения, использование дополнительных материалов (растворы антигена).

Сущность изобретения

Цель изобретения заключается в разработке способа определения функциональной активности специфических антихламидийных антител класса IgG путем оценки интенсивности их взаимодействия с антигеном (аффинности) после обработки растворами тиоционата аммония.

Способ осуществляют следующим образом:

В предварительно промытые (однократно) фосфатным буфером лунки полистиролового планшета с иммобилизированными хламидофилезными антигенами основного белка наружной мембраны хламидий (МОМР Chlamydia) во все лунки вносят по 80 мкл раствора для разведения сывороток. Затем в любые две лунки вносят по 20 мкл отрицательного контрольного образца (К^-), в следующие две лунки по 20 мкл положительного контрольного образца (К⁺) и в следующие пять лунок (А1-А5) по 20 мкл предварительно разведенной испытуемой сыворотки, содержащей антитела к хламидиям. Положительную на хламидии сыворотку пациентов берут в разведении, дающем при длине волны 492 нм оптическую плотность 1000-1500 единиц. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут. В результате инкубации происходит фиксация антител на антигене (образование комплекса антиген-антитело). После инкубации в термостате и последующей отмывки фосфатным буфером для удаления не связавшихся с антигеном антител в лунки с контрольными образцами и одну лунку с испытуемой сывороткой (А5) добавляют 100 мкл фосфатного буфера. В оставшиеся четыре лунки, содержащие испытуемую сыворотку (А1-А4), добавляют 100 мкл тиоционата аммония (CH₄N₂S - о.с.ч.) («MERCK», Германия) в различных концентрациях (1,0; 1,5; 2,0; 2,5 М) и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Под воздействием детергента слабые связи в комплексе антиген-антитело разрываются и ставшие свободными антитела удаляются в результате пятикратной отмывки лунок планшета фосфатным буфером. Далее во все лунки добавляют 100 мкл раствора конъюгата (антитела против IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена), планшет закрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут. В процессе инкубации образуется новый комплекс антитело-антиген, который содержит ферментную метку (пероксидазу хрена). Антигеном в этом комплексе являются антитела против IgG человека. После инкубации повторяют процедуру отмывки для удаления не связанных антител. Затем добавляют 100 мкл раствора хромогена и инкубируют при комнатной температуре в защищенном от света месте 20 минут. В результате химической реакции при взаимодействии пероксидазы хрена и хромогена раствор окрашивается. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл стоп-реагента. Интенсивность окрашивания оценивают по величине оптической плотности с помощью фотометра при длине волны 492 нм.

Относительную величину аффинности антител определяют по формуле: RHAV=А1×7+А2×6+A3×5+А4×4, где A1, A2, A3, А4 - процент от начального количества антител, оставшихся в лунке после их обработки тиоционатом аммонием в концентрациях 2,5; 2,0; 1,5; 1,0 М соответственно. За 100% (начальное количество) принимают величину оптической плотности, отражающую содержание антихламидийных антител в испытуемой сыворотке, которая не подвергалась воздействию тиоционата аммония (А5).

Установлено, что значение RHAV < 500,0 усл.ед. характеризует снижение активности В-клеточного звена иммунитета и способствует формированию гуморальных реакций по патологическому типу (патология).

Значение RHAV > 500,0 усл.ед. свидетельствует о полноценном антихламидийном гуморальном ответе (норма).

Значение, равное 500,0 усл.ед., отражает пограничное состояние. При получении данного результата рекомендуется провести повторное исследование через 2 недели.

Пример 1. Сергеева О.А. (история родов № 6438) госпитализирована в стационар в сроке гестации 14 недель по поводу угрозы невынашивания беременности. При обследовании на инфекцию методами ПЦР и ИФА обнаружены антитела (IgG к МОМР Chlamydia) и антигены Ch. trachomatis. Титр специфических антихламидийных IgG составлял 1/80, RHAV= 51,5 усл.ед. На основании данных акушерского анамнеза и лабораторных исследований поставлен диагноз урогенитальной хламидийной инфекции. После проведенной антибактериальной терапии, пациентка была обследована в сроках 27 и 35 недель беременности.

В сроке 27 недель антигены к хламидиям обнаружены не были. Титр антихламидийных IgG составлял 1/320, RHAV = 97,2 усл.ед.

В сроке 35 недель титр специфических IgG составлял 1/160, RHAV= 925,6 усл.ед. Результат ПЦР (на хламидии) - отрицательный. Перинатальный исход беременности, в соответствии с нашими данными, ожидался благоприятным.

Клинический диагноз новорожденной Сергеевой (история развития новорожденной № 56438): Перенесенная хроническая гипоксия легкой степени тяжести. Практически здорова.

Пример 2.

Дубровина О.А. (история родов № 1072) проходила обследование и лечение по поводу урогенитального хламидиоза. При первичном обследовании в сроке гестации 7 недель методом ПЦР обнаружены антигены Ch.trachomatis. В сроке 10 недель - IgM (титр 1/200) и IgG (титр 1/640), значение RHAV (IgG к МОМР Chlamydia) составило 285,0 усл.ед. Верифицирован диагноз острой хламидийной урогенитальной инфекции и проведено соответствующее лечение. В сроках беременности 13 и 18 недель антигены Ch.trachomatis выявлены не были. После родов проведено повторное серологическое обследование: титр антихламидийных IgG -1/2560, RHAV = 221,0 усл.ед.

На основании полученных результатов лабораторного обследования предполагался неблагоприятный перинатальный исход беременности.

Клинический диагноз новорожденного Дубровина (история развития новорожденного № 51072): инфекция перинатального периода (острый инфекционный энтероколит, гипотоксические нарушения ЦНС).

Пример 3 Музофарова А.В. (история родов № 540) поступила в акушерское отделение в сроке 40-41 недель беременности. Согласно данным акушерского анамнеза во II триместре беременности пациентка получила лечение по поводу урогенитального хламидиоза. Перед родами проведено серологическое обследование на выявление антител к хламидиям. Обнаружены IgG к Ch.trachomatis в титре 1/40, RHAV = 588,8 усл.ед. Достаточно высокая активность аффинных антител позволяла прогнозировать минимальный риск развития хламидийной инфекции у новорожденного.

Клинический диагноз ребенка Музофарова (ист. развития новорожденного №50540): здоров.

Таким образом, приведенные выше примеры демонстрируют возможность использования предлагаемого способа оценки функциональной активности антихламидийных антител в качестве дополнительного критерия для диагностики и оценки качества лечения пациента.

Достоверно установлено, что значение величины RHAV антихламидийных IgG антител, большее 500,0 усл.ед., соответствует «полноценному» гуморальному ответу (норма).

Снижении величины RHAV специфических IgG антител менее 500,0 усл.ед антител характеризует незрелость гуморального иммунного ответа (патология). Пациенту требуется иммунокоррекция и соответствующее этиотропное лечение.

Значение, равное 500,0 усл.ед., отражает пограничное состояние. При получении данного результата рекомендуется провести повторное исследование через 2 недели.

Источники информации

1. Климова С.В., Пинегин Б.В., Кулаков А.В. и др. // Иммунология. -1997. - № 3 - С.50-52.

2. Коровина Н.А., Заплатников А.Л., Чебуркин А.В., Захарова И.Н. Цитомегаловирусная инфекция у детей раннего возраста (клиника, диагностика, современные возможности терапии) // Руков.для врачей. -М.: Посад, 1999.-56с.

3. Кулаков А.В., Климова С.В., Ярилин Д.А., Рубцова М.В., Пинегин Б.В. Изучение аффинности естественных антител сыворотки крови человека к компоненту клеточной стенки бактерий - глюкозаминилмурамилдипептиду, обладающей адъювантной активностью // Иммунология. - 1997. -№1.-С.21-24.

6. Bodeus M., Feyder S., Goubau P. Avidity of antibodies distinguishes primary from non-primary cytomegalovirus infection in pregnant women // Clin. Diagn. Virol. - 1998. - Vol. 9. - (1). - Р. 9 - 16.

7. Matikainen M.T., Lehtonen O.P. Relation between avidity and specificity of monoclonal anti-chlamydial antibodies in culture supernatants and ascitic fluids determined by enzyme immunoassay. // J. Immunol. Methods. - 1984. -Vol. 72.-(2).-P. 341-347.

8. Luxton R.W., Thompson E.J. Affinity distributions of antigen-specific in patients with multiple sclerosis and patients with viral encephalitis // Journal of Immunological Methods. - 1990. - Vol. 131. - P. 277 - 282.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для определения функциональной активности антихламидийных IgG антител. Сущность способа состоит в том, что функциональную активность антихламидийных IgG антител в сыворотке крови определяют по величине относительной аффинности (RHAV) на основе исследования интенсивности связывания комплекса антиген-антитело после обработки растворами тиоционата аммония в различных концентрациях и при величине RHAV менее 500 определяют низкую функциональную активность антихламидийных антител, а при значении RHAV более 500 определяют высокую функциональную активность антихламидийных антител. Техническим результатом является разработка высокочувствительного способа определения функциональной активности антихламидийных IgG антител, который может быть использован в качестве дополнительного критерия для серодиагностики хламидиоза и оценки качества лечения пациента.

Способ определения функциональной активности антихламидийных антител по величине относительной аффинности, отличающийся тем, что в лунки планшета с иммобилизованным антигеном МОМР Chlamidia вносят контрольные и опытные образцы сыворотки, инкубируют, добавляют тиоцианат аммония в

концентрациях 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 М, инкубируют, отмывают фосфатным буфером, определяют количество антител по величине оптической плотности, а функциональную активность антихламидийных антител (RHAV) рассчитывают по формуле RHAV=А1·7+А2·6+А3·5+А4·4, где А1, А2, A3, А4 представляет собой процент антител, оставшихся в лунке после их обработки тиоцианатом аммония в концентрациях 2,5, 2,0, 1,5, 1,0 М, соответственно, и при величине RHAV менее 500 определяют низкую функциональную активность антихламидийных антител, а при значении RHAV более 500 определяют высокую функциональную активность антихламидийных антител.