Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение касается композиции, содержащей ферменты и методологии их применения в качестве противоинфекционных агентов в контексте лечения или снижения риска инфекций пищеварительного тракта.
Уровень техники
В Ревизии 1998 г. Оценок и прогнозов по населению Земли Министерства экономических и социальных проблем населения США предполагалось, что население Земли достигнет в 1999 г. 6 миллиардов. В данном заключении также констатировалось, что населению потребовалось только 12 лет для увеличения с 5 до 6 миллиардов по сравнению с 123 годами, потребовавшимися для того, чтобы вырасти от одного до двух миллиардов. К середине XXI века прогнозируемая численность населения составит между 7,3 и 10,7 миллиарда. Значительный рост населения в последнее десятилетие отчасти обусловлен эффективным прибавлением массы при производстве продуктов питания в результате применения технологий и интенсивных способов производства продуктов питания. Что касается роста населения в будущем, то для сохранения темпа роста необходимо более эффективное увеличение массы продуктов питания при их производстве.
Один из подходов, который сделал производство мяса животных более эффективным, включает широкое применение антимикробных химических агентов и антибиотиков в кормах для животных. На крупных фермах распространение инфекции происходит очень быстро в условиях производства при скученности животных. Вследствие этого борьбу с широким распространением заболевания осуществляют путем профилактического и терапевтического применения данных субстанций. Например, распространена практика введения химических агентов в корма для животных с целью борьбы с кокцидиозными инфекциями (например, салиномицина, монензина, роксарзона (3-нитро), халхинола, карбадокса и олахиндокса), а также антимикробных антибиотиков (например, бацитрацина, вирджиниамицина, тилозина, тетрациклина, хлортетрациклина, пенициллина, олеандомицина, новобиоцина, линкомицина, бамбермицинов, апрамицина, спирамицина, эритромицина, неомицинаидр.). Хорошо известно, что данная практика стимулирует рост и улучшает переработку корма.
Повышение уровня множественной антибиотикоустойчивости среди патогенов человека, таких как Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae и Mycobacterium tuberculosis, породило опасения того, что антибиотикоустойчивость, развивающаяся у микробов, ассоциированных с сельскохозяйственными животными, может мигрировать в патогены человека через факторы переноса лекарственной устойчивости. Имеется доказательство, что животные, которые получают корм с антибиотиками, являются источником бактерий, несущих факторы переноса устойчивости. См. статью Hooge, Feedstuffs, 71(20): 59, (1999). Хотя антибиотики, используемые для животных и человека, в основном различны, существуют аналогии механизмов, которые могли бы привести к перекрестной устойчивости. В одном случае фторхинолоны являются разрешенным средством борьбы с инфекциями Е. coli (колибактериоз) у некоторых животных и используются также для лечения человека. См. статью Hooge, supra. Недавно FDA/CVM (Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США) предложили отозвать разрешение на применение фторхинолона энрофлоксацина для лечения птицы вследствие появления фторхинолон-устойчивого Campylobacter и переноса его человеку. См. статью Murhead S., Feedstuffs, 72(45): 1-4 (2000).
В отраслях промышленности, связанных с производством мяса, существует также обеспокоенность, что при запрете на применение антибиотиков и антимикробных агентов в кормах может произойти потеря прибыли и могут вновь возникать заболевания животных. Например, в 1986 г. в Швеции было запрещено применение кормовых антибиотиков и повысилась частота заболеваний животных. Это сопровождалось увеличением применения антибиотиков в терапевтических целях, что привело к общему увеличению применения антибиотиков, а также повышению цен на продукцию мясного животноводства. См. статью Smith, Feedstuffs, 71(13): 1, (1999). В декабре 1998 г. Совет министров EU (Европейского союза) решил приостановить применение шести антимикробных агентов, которые были официально разрешены в кормовых стимуляторах роста как отпускаемые без рецепта (Official Journal of the European Communities 29.12.98, Положение Совета No. 2821/98 касательно Директивы 70/524). Две добавки на основе хиноксалина были также запрещены в августе 1999 г. вследствие обеспокоенности относительно остаточных количеств в мясе. Результатом данных действий является увеличение частоты распространения формально подавленных состояний, включая некротический энтерит у бройлеров, энтерит, вызываемый Clostridium perfringens у отнятых от матки поросят, дизентерию и вызываемую спирохетами диарею у свиней и ассоциированную с Е. coli диарею. См. публикацию Miller в сборнике Труды ассоциации по изучению здоровья животных США, 1999 г. (United States Animal Health Association, 1999 Proceedings), "Применение антибиотиков в производстве продуктов животноводства и перспективы развития устойчивости в Европе".
Смерть 30000 людей в год вызвана нозокомиальными инфекциями резистентных патогенов, но гораздо меньше смертей обусловлено патогенами из продуктов питания. Ни одна из смертей от патогенов из продуктов питания не была связана с антибиотикоустойчивостью (см. статью Smith, supra). Таким образом, неясно, вносит ли вклад применение антибиотиков отраслями промышленности, связанными с производством мяса, в проблему патогенов с лекарственной устойчивостью при нозокомиальных инфекциях у человека. Другим аспектом является отсутствие новых антибиотиков для лечения инфекций, вызываемых устойчивыми патогенами. См. статью Henry С.М., Chemical and Engineering News, 6 марта 2000 г., с.41-58. Это могло бы означать, что при появлении патогенов со значительной антибиотикоустойчивостью может не оказаться новых антибиотиков для лечения инфекций. Сложность создания антибиотиков, размер рынка и регламентирующие документы, по-видимому, были причиной ухода фармацевтических компаний от научных исследований и разработок в области создания антибиотиков, в особенности применяемых для животных. Новые представленные правила регистрации лекарственных препаратов, применяемых для животных, являются настолько сложными, что остановили их создание. См. работу Smith, supra. Однако имеется ряд мелких компаний, участвующих в создании новых антибиотиков (см. работу Henry, supra).
В популяциях некоторых животных инфекция уже имеет пандемический характер. Например, кокцидиоз у птиц представляет собой заболевание, которое только лечат, но которое в действительности не находится под контролем. В действительности все стада инфицированы и введение антикокцидиозных химических агентов обычно чередуют в кормах с целью контроля поражения и ограничения развития устойчивых штаммов. Кокцидиоз стоит производителям птицы 350 миллионов долларов ежегодно в виде потерь и стоимости лечения антибиотическими препаратами, такими как салиномицин. См. публикацию Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, 28 октября, 1997. По имеющимся оценкам в 1999 г. в США на кокцидиостатические препараты будет истрачено около 114 милллионов долларов. См. публикацию Frost и Sullivan, U.S. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report, 5245-54, 1995.
Имеется явная необходимость в изыскании новых и более эффективных способов борьбы с инфекциями пищеварительного тракта животных, которых выращивают с использованием приемов интенсивного фермерского хозяйства. Данная необходимость основана на потребности повышения эффективности продукции, с целью поддержания соответствия с быстро растущим населением Земли. Улучшение контроля кишечной инфекции гарантирует ускоренный рост и повышение эффективности кормов. Имеется также необходимость создания альтернатив применения антибиотиков в животноводстве в связи с соображениями возможного развития антибиотикоустойчивости у патогенов человека.
В случае применения лечения на основе ферментов, которые действуют способом, отличным от всех антибиотиков, не существует риска стимуляции эволюции резистентных патогенных микроорганизмов, которые представляют собой проблему для здоровья человека. Поскольку ферменты являются белками, отсутствует возможность того, что в мясные продукты попадет вредный химический остаток, как случается при использовании некоторых антибиотиков и антикокцидиозных химических агентов. См. American Feed Control Officials Inc., Official Publication, 1999, "Drugs and Feed Additives, Section 30.0 Enzymes," c.206-217, ISBN 1-878341-10-3.
Сущность изобретения
Таким образом, объектом объектом данного изобретения является разработка ферментативного лечения для снижения воздействия инфекций пищеварительного тракта.
Другим объектом данного изобретения является создание механизма снижения воздействия инфекций пищеварительного тракта путем нарушения связывания патогенов с клетками пищеварительного тракта.
Еще одним объектом изобретения является создание подхода, обеспечивающего улучшение прибавления массы тела и переработки корма для животных, которые инфицированы патогенами, вызывающими инфекции или некротический энтерит.
Следующим объектом данного изобретения является получение лекарственной формы, пригодной для перорального введения, которая является эффективной в плане улучшения состояния субъекта, инфицированного микробным патогеном или с риском инфекции микробным патогеном.
Для осуществления данных и иных объектов в соответствии с одним из аспектов данного изобретения предложена также композиция, содержащая (i) фермент, который расщепляет связь фосфатидилинозита с выходом клеточного поверхностного белка или углевода, и (ii) физиологически приемлемый носитель фермента, причем указанная композиция представлена в форме, пригодной для перорального применения и не содержит иной, чем указанный фермент, противоинфекционный агент. В одном из вариантов осуществления рассматриваемый фермент расщепляет связь, которая обусловливает выход клеточного поверхностного белка.
В предпочтительном варианте осуществления фермент, включенный в композицию, представляет собой сфингомиелиназу или фосфолипазу, в особенности фосфолипазу типа С или типа D. В другом предпочтительном варианте осуществления фермент выбран из группы, состоящей из цереброзидаз и карбогидраз, которые расщепляют связь, что приводит к выходу клеточного поверхностного белка или углевода. В другом варианте осуществления фермент получен из штамма Bacillus cereus, предпочтительно АТСС 7004 или АТСС 6464. Альтернативно фермент получают путем экспрессии рекомбинантной ДНК, кодирующей фермент, в Bacillus megaterium. В другом варианте осуществления фермент содержится в оболочке желатиновой капсулы и присутствует в композиции в концентрации 200 - 4000 IU/кг корма.
В соответствии с другим аспектом данного изобретения представлена композиция, содержащая вышеупомянутые компоненты (i) и (ii), в которой физиологически приемлемый носитель представляет собой кормовой продукт, в который введен фермент. Таким образом, композиция может быть представлена кормом для животных, который не содержит иной, чем данный фермент, противоинфекционный агент. Композиция корма для животных, соответствующая данному изобретению, содержит кроме того зерновой материал, такой как кукуруза, сорго, пшеница, ячмень или овес, источник белка, такой как бобы или горох, а также витамины, аминокислоты и минералы.
В соответствии с другими своими аспектами данное изобретение представляет композицию, как описано выше, которая находится в твердой или жидкой лекарственной форме.
Далее представлен способ лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта, предусматривающий пероральное введение субъекту, страдающему от инфекции или с риском поражения данной инфекцией, эффективного количества фермента, который расщепляет связь фосфатидилинозита, что приводит к выходу клеточного поверхностного белка или углевода. Кроме того, способ не включает введение противоинфекционного агента, отличного от самого фермента. Инфекция может быть вызвана патогенными простейшими, такими как Eimeria и Cryptosporidium, бактериями, такими как Clostridium, грибами или дрожжами.
Кроме того, представлена еще композиция, содержащая (i) фермент, представляющий собой карбогидразу или цереброзидазу, и (ii) физиологически приемлемый носитель фермента, где композиция находится в форме, пригодной для перорального введения, и не содержит иной, чем данный фермент, противоинфекционный агент.
Далее представлен также способ лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта, предусматривающий пероральное введение субъекту, страдающему от указанной инфекции или с риском поражения указанной инфекцией, эффективного количества фермента, представляющего собой карбогидразу или цереброзидазу, при этом способ не включает введение вместе с ферментом эффективного в отношении микробов количества другого противоинфекционного агента.
Другие объекты, признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из последующего детального описания. Детальное описание и специальные примеры, хотя они и представляют предпочтительные варианты осуществления, приведены только с целью иллюстрации, поскольку из данного детального описания для компетентных специалистов в данной области будут очевидными различные изменения и модификации, входящие в сущность и объем притязаний изобретения. Кроме того, примеры демонстрируют принцип изобретения и нельзя ожидать, что они будут специально иллюстрировать применение данного изобретения в отношении всех примеров инфекций, против которых эффективность будет очевидной для компетентных специалистов в данной области.
На чертеже представлена активность рекомбинантного фермента PI-PLC, продуцируемого штаммом Bacillus megaterium, в отношении криптоспоридий.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Было обнаружено, что ферменты определенного класса, характеризующиеся способностью расщеплять связь с выходом клеточного поверхностного белка или углевода, проявляют при пероральном применении значительную антибиотическую активность, которая является эффективной, например, при лечении инфекций пищеварительного тракта. Класс ферментов включает в себя, без ограничения перечисленным, сфингомиелиназы и фосфолипазы типа С и D и ферменты с аналогичной специфичностью расщепления. Вследствие этого примерами данного класса являются ферменты, которые расщепляют и высвобождают гликопротеины или углеводы, которые заякорены в мембране посредством связи с фосфатидилинозитом. Таким образом, фермент фосфатидилинозит-специфическая фосфолипаза С (E.G. 3.1.4.10), известная также под аббревиатурой PI-PLC или как 1-фосфатидилинозитфосфодиэстераза, является членом данного класса. Другим примером является гликозил-фосфатидилинозит-специфическая фосфолипаза D или GPI-PLD. См. статью Low и Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 980-984 (1988).
Ферменты GPI-PLD и PI-PLC были описаны как выделенные из эукариотических источников. См. раздел, написанный Low "Разложение якорей гликозил-фосфатидилинозита специфическими фосфолипазами" (Degradation of glycosyl-phosphatidylinositol anchors by specificphospholipases"), глава 2, стр.35-63, в монографии "Молекулярная и клеточная биология мембранных белков - гликолипидные якори клеточных поверхностных белков" (Molecular and Cell Biology of Membrane Proteins: Glycolypid Anchors of Cell-Surface Proteins) под ред. A.J.Turner, Ellis Horwood, New York, 1990, статьях Low и Prasad, Proc. Natl. Acad. Scl., 85: 980-984(1988); Essen и соавт., Nature, 380: 595-602, (1996) и Essen и соавт., Biochemistry, 36: 2753-2762 (1997). Описана PI-PLC, выделенная из прокариотических источников, включая экстрацеллюларное образование бактериями. Среди известных бактериальных источников PI-PLC представлены Bacillus cereus (см. статьи Stein и Logan, J. Bacterlol., 85: 369-381, (1963); Stein и Logan, J. Bacteriol., 90: 69-81, (1965); Ikezawa и соавт., Biochimica et Biophysics Acta 450: 154-164, (1976); Griffith и соавт., Methods in Enzymology, 197: 493-502, (1991); Volwerk и соавт., J. Cell. Biochem., 39: 315-325, (1989) и Kuppe и соавт., J. Bacteriol., 171: 6077-6083, (1989)), Bacillus thuringiensis (см. статью Ikezawa и Taguchi, Methods in Enzymology, 71:731-741, (1981); Патентный документ Японии JP 55034039), Staphylococcus aureus (см. статью Low и Finean, Biochem J., 162: 235-240,(1977)) и Clostridium novyi (см. статью Taguchi и Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys., 186: 196-201, (1978)).
Были изобретены усовершенствованные способы ферментного анализа на основе флуоресцентного субстрата для фермента PI-PLC. См статьи Hendrickson и соавт., Biochemistry, 31: 12169-12172, (1992); Hendrlckson, Anal. Biochem., 219: 1-8, (1994); Hendrickson и соавт., Bioorg. Med. Chem. Letters. 1: 619-622, (1991).
He придерживаясь определенным образом никакой теории, данные изобретатели подчеркивают, что фермент PI-PLC обладает способностью расщеплять фосфатидилинозитгликолипидные якори поверхностных клеточных белков и других гликозилфосфатидилинозитов. См. статьи Low, supra; Low и Saltiel, Science 239: 268-275,(1988). Например, различные поверхностные гликопротеины и другие поверхностные белки и углеводы ряда паразитических простейших заякорены гликозилфосфатидилинозитовыми липидами (GPI-якорями) и чувствительны к расщеплению и выходу под действием PI-PLC. Иллюстративные виды принадлежат к родам Schistosoma, Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma и Leishmania (см. статью Low, supra), а также Eimereia, Babesia, Theileria, Giardia, Leptomonas и Entamoeba. См. статьи McConville и Ferguson, Biochemical J., 294: 305-324, (1993); Pearce и Sher J., Immunol., 142: 979-984, (1989); Sauma и соавт., Mol. Med. Biochem. Parasitol., 46: 73-80, (1991); Hawn и Strand, Mol. Med. Biochem. Parasitol., 59: 73-82, (1993).
Данный заякоривающий механизм компонентов клеточной поверхности, по-видимому, является универсальным для эукариотических клеток в диапазоне от клеток дрожжей до млекопитающих. Присутствие GPI-якорей у Giardia lamblia, которую считают очень примитивным эукариотическим организмом, позволяет предположить, что данный вид якоря рано развивается у эукариот. Согласующимся с данным положением является открытие у архебактерий нового фосфоглицеролипида GlcNal-6-мио-инозит-Р-диалкилглицерола (см. статью Nishihara и соавт., J. Biol. Chem., 267: 12432-12435, (1992)), который представляет собой основу более сложных структур эукариотических GPI-якорей, которые возникли в процессе эволюции. У простейших система GPI-заякоривания используется более сильно, чем у высших эукариот, и имеется доказательство, что GPI-заякоренные структуры являются важными для выживания паразита в насекомых и млекопитающих-хозяевах (см. статью (McConville и Ferguson, supra). Например, часто встречающееся прикрытие различных поверхностных гликопротеинов может быть механизмом избежания атаки иммунной системы.
Простейшее Eimeria tenella содержит фосфатидилинозит-заякоренные структуры, подобные гликопротеину/гликолипиду Trypanosoma brucei. Полагают, что данные структуры являются важными для присоединения к мембране и последующей инфекции. См. статью Gumett и соавт., Mol. Med. Biochem. Parasitol., 41: 177-186, (1990). Структуры Eimeria расщепляются липазой трипаносом и PI-PLC Bacillus thuringiensis (см. статью Gumett, supra). Лечение паразитов in vivo с помощью PI-PLC, если будет показана его осуществимость, вероятно, помогло бы иммунной системе и нарушило бы присоединение и инфекцию патогенов, попавших в пищеварительный тракт. Виды Eimeria представляют собой широко распространенную и дорогостоящую проблему в птицеводстве. Другое паразитическое простейшее, Cryptosporidium parvum, широко распространено и вызывает острую диарею у человека и многих животных. На основании последовательности ДНК и того, что моноклональные антитела, реактивные с данным белком спорозоита, подавляют инфекцию, предсказано, что белок спорозоита GPI 5/45/60 является GPI-связанным белком (см. статьи Strong W.B., и соавт., Infection and Immunity, 68: 4117-4134, (2000); Cevallos A.M. и соавт., Infection and Immunity, 68: 4108-4116, (2000)). Таким образом, С. parvum является другим патогеном, который потенциально лечится с помощью PI-PLC.
Прокариотические бактерии не содержат поверхностные гликопротеины и углеводы, заякоренные фосфатидилинозитом (см. статью McConville и Ferguson, supra), но PI-PLC также могла бы снизить бактериальные инфекции путем нарушений процесса присоединения. Патогенная Е. coli и ряд других хорошо известных патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae экспрессируют бактериальный адгезин FimH - связывающий маннозу лектин мол. массы 29 кД, присутствующий на дистальном конце фимбрий. См. статью Abraham и соавт., Nature, 336: 682-684, (1988). Было показано, что данный адгезин связывается с CD48 мастоцитов - GPI-заякоренной молекулой. См. статью Malaviya и соавт., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 96: 8110-8115, (1999). Расщепление in vitro с помощью PI-PLC снижает связывание мутантного GPI-заякоренного рецептора дифтерийного токсина (из Corynebacterium diphtheria) с мышиными клетками NIH3T3. См. статью Lanzrein и соавт., EMBO J., 15: 725-734, (1996). Кроме того, оба, альфа-токсин Clostridium septicum и аэролизин Aeromonas hydrophila, присоединены к клеточной поверхности посредством С-концевого GPI-якоря и могут быть удалены с клеточной поверхности при обработке PI-PLC. См. статью Gordon и соавт., J. Biol. Chem., 274: 27274-27280, (1999).
Для PI-PLC механизм снижения эффекта бактериальной инфекции связан с освобождением CD48-связывающего центра мастоцитов-хозяев. Кроме того, связывание FimH с мастоцитами запускает воспалительную реакцию. Вследствие этого в соответствии с данным изобретением уменьшение числа центров связывания также снижало бы воспаление, которое могло бы стать чрезмерным и повредить здоровью самого кишечника, поскольку воспалительная реакция включает выход фактора некроза опухоли α (см. статью Malaviya, supra). Так, посредством данного механизма снижения воспаления и последующей секреции фактора некроза опухоли лечение фосфолипазой в соответствии с данным изобретением должно облегчать симптомы, характеризующиеся такими состояниями, как синдром раздраженной кишки, колит и болезнь Крона. См. статью van Deventer S.J., Ann. Rheum. Dis., 58(1): I114-I120 (ноябрь, 1999).
Данное изобретение было бы эффективным также в отношении вирусных инфекций вследствие нарушения связывания вирусных частиц и клеток, которые вирус инфицировал бы in vivo. В свете обнаружения данными изобретателями эффективности перорального применения, описанной в данном контексте, интересно, что предварительная обработка вируса гриппа фосфолипазой С, вызывающая выход приблизительно 50% вирусного фосфолипида, приводила к значительному снижению инфекционности в отношении куриных эмбрионов. См. статью Mizutani и соавт., Nature, 204: 781-782, (1964). Напротив, предварительная обработка культивируемых фибробластов куриных эмбрионов фосфолипазой С, выделенной из Clostridium perfringens, в значительной степени подавляла в клетках последующую инфекцию вируса Semliki Forest. См. статью Friedman и Pastan, Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 59: 1371-1378, (1968). Хотя область техники недальновидно не признает терапевтической важности данных феноменов, они согласуются с одним механизмом, который, как полагают, лежит в основе данного изобретения, а именно: расщепление связи патоген-поверхностный лиганд или близкий ему рецептор клеточной мембраны нарушает взаимодействие, необходимое для инфекции.
Другой аспект, где данное изобретение может быть эффективным в плане предупреждения вирусной инфекции, представляет собой блокирование связывания вирусных GPI-заякоренных белков с чувствительными клетками. Примером вирусного GPI-заякоренного белка, который чувствителен к расщеплению с помощью PI-PLC, является вирус Денге NS1 (неструктурный белок 1). См. статью Jacobs и соавт., FASEB J., 14: 1603-1610, (2000). Имеется ряд примеров GPI-заякоренных белков клеток-хозяев, которые представляют собой центры связывания вирусов. Данные примеры включают человеческий эховирус 6, 7, 12 и 21, а также энтеровирус 70, которые связывают GPI-заякоренный CD55 (фактор, ускоряющий распад, DAF). См. статьи Clarkson и соавт., J. Virology, 69: 5497-5501, (1995); Bergelson и соавт., Ргос. Natl. Acad. Scl. USA, 91: 6245-6248, (1994) и Kamauchow и соавт., J. Virology, 70: 5143-5152, (1996). Инфекции собачьего парвовируса (CPV) можно блокировать in vitro предварительной обработкой кошачьих клеток с помощью PI-PLC. См. статью Barbis и Parrish, Brazilian, J. Med. Biol. Res., 27: 401-407, (1994).
Некоторые клеточные поверхностные рецепторы, имеющие определенное значение в инициировании инфекций, присоединены к мембранам с помощью механизмов, отличных от GPI-якорей. Они включают такие структуры, как холестериновые сложные эфиры (см. статью Rostand и Esko, J. Biol. Chem., 268: 24053-24059, (1993)), нефосфорилированные гликосфинголипиды (Karlsson, Am. Rev. Biochem., 58: 309-350, (1989)) и другие фосфолипиды, такие как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. См. статью Sylvester, Infect. Immun., 64: 4060-4066, (1996).
Вследствие этого по вышеуказанным причинам направленность на данные структуры соответствующих эстераз, цереброзидаз, карбогидраз и фосфолипаз, активных в плане высвобождения данных структур из клеточных поверхностей, дала бы положительные эффекты при пероральном введении в соответствии с данным изобретением при лечении инфекций пищеварительного тракта.
В силу универсальной природы поверхностных белков и углеводов, связанных посредством фосфатидилинозита, у эукариот терапевтическая методология, соответствующая данному изобретению, предусматривающая в остром случае или профилактически введение фермента с целью расщепления заякоривающей связи данных поверхностных клеточных белков или углеводов, найдет широкое применение при лечении инфекций пищеварительного тракта простейшими, бактериями, грибами и вирусами. С этой стороны, ключевым аспектом данного изобретения является демонстрация того, что фермент, активный не только в плане расщепления компонентов поверхности клетки, может быть перорально введен в качестве противоинфекционного агента и быть эффективным in vivo. Примечательно, что, хотя репрезентативный подходящий фермент, PI-PLC, был доступен с 1960-х годов, данный подход ранее не предлагался.
Другим аспектом данного изобретения является применение фермента, как описано выше, в качестве эффективного противоинфекционного агента в кормовых препаратах для животных, которые служат для лечения или снижения риска инфекций пищеварительного тракта у животных, которые употребляют корм. Известны кормовые препараты, которые содержат эндо-1,4-β-D-маннаназу, и в ряде публикаций имелось предположение о противогрибковой активности маннаназы. См. патентную публикацию WO 00/21381 (РСТ/ЕР 99/07835) и статью Kudo и соавт., Experentia, 48: 227-281, (1992). В данных случаях маннаназу комбинируют с известным антибиотиком, хотя в общем плане обсуждалась перспектива применения фермента в корме, не содержащем антибиотик. См. публикацию Adams, Feed Mix (Special 2000), стр.16-18.
Вследствие этого в одном из своих аспектов настоящее изобретение касается композиций, включая кормовые композиции, которые содержат фермент, характеризующийся вышеупомянутой активностью расщепления, который отличен от маннаназы или, в частности, отличен от эндо-1,4-β-D-маннаназы, как отличается, например, от маннан-направленного фермента с иной специфичностью расщепления, как описано в Номенклатуре ферментов (Enzyme Nomenclature) 1992 (Academic Press) (см. разделы 3.2.1.77, 3.2.1.78, 3.2.1.101, 3.2.1.106, 3.2.1.130 и 3.2.1.137). Кроме того, настоящее изобретение подразумевает композицию, которая содержит данный фермент, включая маннаназу, но не содержит никакой другой противоинфекционный агент.
Таким образом, в соответствии с данным изобретением неклеточный ферментный препарат, полученный из Bacillus cereus и стандартизованный по содержанию PI-PLC, может быть использован для получения очень значительного улучшения в плане прибавки массы тела и усвоения корма при наличии инфекции. Данный результат является неожиданным, поскольку B. cereus является оппортунистическим патогеном, который обычно вызывает связанные с кормом гастроэнтериты и эндофтальмит, обусловленный B. cereus.
В ранних исследованиях показано, что инъекция экстрацеллюларного фермента В. anthracis или В. cereus кроликам вызывает фосфасемию и даже гибель. Например, см. статью Stein и Logan, J. Bacterlol., 85: 369-381, (1963). Вследствие этого неожиданно, что экстрацеллюларный фермент из патогена, который вызывает гастроэнтерит, согласно данному изобретению мог бы обладать лечебным действием в отношении заболевания, вызываемого бактериальной инфекцией.
Bacillus cereus вырабатывает множество экстрацеллюларных активных в отношении мембраны ферментов и цитолитических токсинов, включая PI-PLC и цереолизин АВ, состоящий из фосфолипазы С и сфингомиелиназы. См. статью Gilmore, J. Bacteriol., 171: 744-753, (1989). Полагают, что в вышеупомянутом ферментном препарате экстрацеллюларная фосфатидилинозит-специфическая фосфолипаза С [E.G. 3.1.4.10], образуемая 8. cereus, является активным ингредиентом. Ферментный лечебный препарат, соответствующий данному изобретению, эффективно действует как кокцидиостатик и антибиотик. Вследствие этого данный подход является эффективным и коммерчески приемлемым для лечения инфекций пищеварительного тракта, в особенности в случае запрета используемых в настоящее время субстанций.
При отсутствии покрытия ферменты могут необратимо инактивироваться желудочным соком. В Патенте США No. 4079125 описаны усовершенствованные содержащие ферменты композиции с энтеросолюбильным покрытием для приема через рот млекопитающими с дефицитом ферментов. Удивительно, что введение PI-PLC в корм для животных без покрытия обеспечивает эффективное лечение инфекций патогенов.
Предпочтительно ферментные композиции, соответствующие изобретению, приготовлены в виде в виде сухих, твердых или жидких композиций для перорального применения. Данные композиции в основном будут включать стабилизаторы, такие как буфер, углевод и/или гликоль. Сухие препараты ферментов, стабильные при хранении, которые являются пригодными, в соответствии с данным изобретением, для введения в таблетки или капсулы, могут быть, например, приготовлены путем лиофилизации, распылительной сушки в сушилке с псевдоожиженным слоем с инертным или углеводным носителем или путем использования технологий выпаривания в сочетании со стеклообразующими стабилизаторами. См. статью Franks и соавт., Biopharm., 4: 38-55, (1991). Другой подход включает осаждение соли, например, получение осадка с помощью сульфата аммония или растворителя и использование ацетона для получения порошка с последующей сушкой и перемешиванием с носителем.
Некоторые углеводы, в особенности моносахариды, дисахариды и низшие олигосахариды представляют собой важные стеклообразующие углеводы. Примерами углеводов для применения в качестве носителей являются в числе других ксилоза, фруктоза, глюкоза, сорбит и мальтотриоза, как описано в статье Franks, supra. Выбор углеводного носителя основан на совместимости с ферментом, тенденции к низкой гигроскопичности и удовлетворительной кривой стеклования. Стабилизатор трегалоза является особенно подходящим для получения биологических агентов, стабильных при комнатной температуре. См. Патент США No. 4891319, статьи Roser, Biopharm. 4 (8): 47-53, (1991); Colaco и соавт., Bio/Technology, 10: 1007-1011, 1992; публикацию Aldridge, Genetic Engineering News, 15 марта 1995 г., стр.10-11.
Ферменты, соответствующие данному изобретению, могут быть приготовлены в виде жидкостей, например, в виде сиропов, содержащих сорбит или глицерин, для снижения активности воды и стабилизации белка. Данные растворы, как правило, стерилизуют фильтрацией перед фармацевтическим применением.
Как отмечено ранее, данное изобретение в одном из аспектов касается доставки фермента в виде компонента корма или продукта питания. Корма состоят в основном из зернового материала, источника белка, витаминов, аминокислот и минералов. Зерновой материал, как правило, включает кукурузу, сорго, пшеницу, ячмень или овес. Источником белков могут быть, например, бобы или горох. Примеры минералов, аминокислот и витаминов включают В12, А, пантотеновую кислоту, никотиновую кислоту, рибофлавин, К, DL-метионин, L-лизин, холина хлорид, фолиевую кислоту, фосфат дикальция, сульфонат магния, сульфат калия, карбонат кальция, хлорид натрия, селенит натрия, оксид марганца, иодат кальция, оксид меди, оксид цинка и D-активированный стерин животного происхождения.
Для применения в кормах жидкий препарат фермента может быть приготовлен с водным раствором соли (например, NaCl, 15-18% мас./мас.) или с сиропом для снижения активности воды и предотвращения роста микробов в концентрированном продукте. Другие консерванты для корма, такие как бензоат натрия, пропилпарабен, сорбат натрия или калия и аскорбилпальмитат представляют собой примеры разрешенных химических консервантов, которые также могут быть использованы для предотвращения потенциальной порчи вследствие микробного роста в продукте. См. Association of American Feed Control Officials (Ассоциация американских официальных контролеров по кормам), Inc., Official Publication (Официальная публикация) 2000, часть 18, "Химические консерванты" ("Chemical Preservatives"), стр.215-217, ISBN 1-878341-11-1. Данные консерванты могут применяться в кормах посредством дополнительного гранулирования с использованием большого разведения с использованием технологии автоматизированного распыления. См. публикацию Fodge и соавт., Feedstuffs, 29 сентября 1997. Данные жидкие препараты могут содержать стабилизирующие углеводы, такие как сорбит или глицерин при совместимости. Для повышения эффективности могут быть включены материалы, которые являются желательными компонентами корма, такие как другие термолабильные ферменты или витамины.
В случаях, когда корм используют в негранулированной кормовой смеси (т.е. не прошедшей тепловую обработку), ферменты, соответствующие данному изобретению, могут быть представлены в виде сухого концентрата для добавления в смеситель для корма. Такие сухие концентраты ферментов готовят путем первого концентрирования жидкого препарата фермента, используя NMWC 10 кД или другой подходящий ультрафильтр для достижения высокого процента содержания фермента, с последующим смешиванием с очень сухим носителем, таким как кукурузная крупа, соевая крупа или даже инертный материал или нерастворимая соль, которые разрешены к применению в кормах. См. Official Publication, American Feed Control Officials, supra. Часть 582, "Субстанции, в основном рассматриваемые как безопасные к кормах для животных" ("Substances generally regarded as safe in animal feeds.")
Существует ряд способов получения ферментов, достаточно стабильных для того, чтобы переносить процесс гранулирования в некоторых мельницах для кормов при пониженных температурах с сохранением достаточной активности для того, чтобы работать в пищеварительном тракте. Хорошо известно, что модификация структуры белка, во-первых, путем изменения кодирующей последовательности ДНК или, во-вторых, путем химической модификации может сделать ферменты более стабильными в отношении инактивации. В этом плане одной из иллюстраций является применение химического перекрестного сшивания кристаллов ферментов. См. статью Collins и соавт., Organic Process Research and Development, 2(6): 400-406, (1998). Другой подход к повышению стабильности фермента, соответствующего данному изобретению, предусматривает изменение аминокислот путем мутагенеза гена, который кодирует представляющий интерес фермент, или путем получения генов или фрагментов генов для перетасовки. См. статьи Crameri и соавт., Nature, 391: 288-291, (1998); Arnold, Nature Biotechnol., 16: 617-618, (1998b); Zhao и соавт., Nature Biotechnol., 16: 258-235, (1998); Zhao и Arnold, Protein Eng., 12: 47-53, (1999). Возможной является также мутация и селекция для "направленной эволюции" ферментов с желательными свойствами. Например, см. статьи Giver и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 12809-12813, (1998); Liao и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 576-580, (1986); Cherry и соавт., Nature Biotechnol., 17: 379-384, (1999).
Некоторые модификации белков, включая гликозилирование, полиэтиленгликилирование и сукцинилирование, также могут повышать стабильность и изменять оптимум рН, характеристики, которые могли бы быть оптимизированы у ферментов, предназначенных для применения в данном изобретении. Таким образом, в этом плане известные протоколы можно было бы использовать для получения модифицированного фермента для тестирования в соответствии с примерами с целью оценки применимости в соответствующей изобретению методологии лечения.
Эффективный способ получения PI-PLC основан на клонировании гена 6. cereus в В. megaterium. Экспрессионная система (см. статью Rygus и Hillen, Appl. Microbiol. Bacteriol., 35: 594-599, (1991)) позволяет применять элементы из регулона ксилоэы Bacillus megaterium (см. статью Rygus и соавт., Arch. Microbiol., 155: 535-542, (1991)) и коммерчески производится В10101 Corp. (Vista, California). Получают слияние лидерной кодирующей последовательности гена PI-PLC и первых трех аминокислот гена xylA В. megaterium в плазмиде, стабилизированной устойчивостью к тетрациклину и регулируемой чувствительным к ксилозе репрессором. Штаммы данного типа с усиленной экспрессией представляют собой средство, пригодное для получения PI-PLC в коммерчески приемлемых количествах для включения в корм для животных в соответствии с данным изобретением.
Некоторые изоляты Bacillus cereus продуцируют антибиотики, такие как туникамицин. См. статью Kamogashira и соавт., Agric. Biol. Chem., 52:859-861, (1988). Другой изолят Bacillus cereus (ATCC 53522) описан в Патентах США No. 4877738 и No. 5049379 как агент для биологической борьбы для предупреждения черной ножки и корневой гнили растений. Полагают, что данный эффект является результатом действия двух антибиотиков, названных цвиттермицином (линейным аминополиолом мол. массы 396 Д) и антибиотиков В аминогликозидной природы. В детально описанных ниже примерах возможность присутствия данных двух антибиотиков устранена путем удаления возможных низкомолекулярных антибиотиков из ферментного препарата.
В частности, бесклеточный ферментационный бульон концентрируют с помощью мембраны, удаляющей молекулы с молекулярной массой 10 кД. Концентрат, содержащий белок с молекулярной массой, превышающей 10 кД, используют для дальнейшей обработки. Низкомолекулярные антибиотики, такие как описаны в статье Handelsman, supra, должны проходить через данный фильтр. Более того, для осаждения высокомолекулярных белков использовали осаждение сульфатом аммония, оставляя низкомолекулярные материалы в растворе. После перерастворения осадка, полученного под действием сульфата аммония, образовавшийся раствор фермента диализуют против буфера в качестве еще одного способа обработки, которая удаляет низкомолекулярные антибиотики. Наконец, белок осаждают второй раз, снова с использованием сульфата аммония, чтобы перевести любые оставшиеся низкомолекулярные соединения в раствор.
Комбинированное применение данных четырех обработок в значительной степени противостоит возможности того, что наблюдаемый антибиотический эффект обусловлен низкомолекулярным антибиотиком, образуемым АТСС 6464 или АТСС 7004. Ферментационный бульон также был проанализирован с использованием тест-штамма Е. coli на присутствие антибиотика, но не была обнаружена никакая антибиотическая активность.
Кроме того, данное изобретение описано ниже со ссылкой на следующие иллюстративные примеры.
ПРИМЕР 1 Приготовление замороженных маточных культур Bacillus cereus АТСС 6464 и АТСС 7004
Флаконы с лиофилизированными клетками, полученные из АТСС, открывают и инокулируют ими посевную среду, содержащую Amberferm 4015 (Red Star) - 10 г/л, Amberex 695 (Red Star) - 5 г/л и хлорид натрия - 5 г/л, рН 7,0, и выращивают при 30°С. Исходную культуру высевают штрихом на чашки с агаризованным бульоном LB и полученной отдельной колонией снова инокулируют 20 мл посевной среды, содержащейся в круглодонной колбе объемом 250 мл (Belico), и выращивают культуру при встряхивании при 30°С. Когда густота культуры достигает OD600 (оптическая плотность), добавляют стерильный глицерин до приблизительно 10% об/об и замораживают флаконы, содержащие 1,8 мл культуры при -80°С.
ПРИМЕР 2 Выращивание изолятов Bacillus cereus АТСС 6464 и АТСС 7004 для получения фосфатидилинозит-специфической фосфолипазы С
Два ферментера Biostat С объемом каждый по 30 литров загружают средой следующего состава, приготовленной на водопроводной воде: питательный бульон No. 2 (Oxoid) - 25 г/л, триптон (Difco) -10 г/л, дрожжевой экстракт (Difco) - 10 г/л и пеногаситель Mazu DP10P Modl 1 (BASF) - 0,1 мл/л. Исходный объем загрузки составляет 9,5 л, и бульон стерилизуют при 121°С в течение 40 минут. Исходный рН подводят до 7,0 с помощью газообразного аммиака после стерилизации.
Посевные культуры готовят в 500 мл той же самой среды в круглодонных качалочных колбах объемом 4 л с устройством аспирационной связи (Belico) с присоединенными силиконовыми трубками с соединителями для инокуляции. Колбы стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 50 минут перед инокуляций 1,8 мл замороженной маточной культуры, приготовленной из образца, доставленного из АТСС (см. Пример 1). Культуры в посевных колбах выращивают при 30°С в течение 5,5 часов при встряхивании со скоростью 200 об/мин в инкубируемой качалке с контролем окружающей среды (NBS модель G-25). Перед инокуляцией культура АТСС 7004 имеет OD600 1,53 и рН 6,58. Культура АТСС 6464 имеет OD600 1,28 и рН 6,79.
Посевными культурами объемом 500 мл инокулируют 30-литровые ферментеры и ведут процесс в следующих условиях: температура 30°С, перемешивание со скоростью 600 об/мин, поток воздуха 10 л/мин и давление 0,5 бар. OD600 исходной культуры составляет 0,81. Через шесть часов ферментацию прекращают при конечном OD600 22,1 для АТСС 7004 и OD600 24,2 для АТСС 6464. Ферментации проводят без контроля рН, и конечное значение рН составляет 8,17 для АТСС 7004 и 8,13 для АТСС 6464. Бульон удаляют из ферментеров и охлаждают до 8°С перед дальнейшей обработкой.
Ферментеры проводят во второй раз с обоими изолятами Bacillus cereus из АТСС с использованием фактически идентичной процедуры. В данном случае используют шестичасовые посевные культуры с OD600 2,86 для АТСС 7004 и OD600 1,98 для АТСС 6464 и значением рН 6,69 для АТСС 7004 и 6,65 для АТСС 6464. Основные ферментации ведут в течение 6,5 часов при конечном OD600 35,9 для АТСС 7004 и OD600 33,6 для АТСС 6464. Конечное значение рН составляет 8,38 для АТСС 7004 и 8,47 для АТСС 6464 ко времени охлаждения.
ПРИМЕР 3 Удаление клеток путем фильтрации и концентрирование фермента PI-PLC
Клетки удаляют и отмывают из каждой из четырех загрузок ферментеров, описанных в Примере 2, используя два фильтра A/G Technology (UFP-500-K-6A) с полым волокном диаметром 3 мм, удаляющим соединения молекулярной массы 500000 (NMWC 500 кД), концы которых соединены друг с другом. Охлажденный бульон прокачивают через фильтры с помощью перистальтического насоса со скоростью приблизительно 2 л/мин с возвращением в резервуар для хранения. Прошедшую через фильтр жидкость, содержащую фермент, собирают в резервуаре, охлажденном на льду. Исходный объем 9 л содержащего клетки бульона концентрируют до приблизительно 2 литров, начиная в данной точке диафильтрацию с помощью 10 мМ трис-HCl, рН 8,5. После сбора общего объема прошедшего через фильтр раствора 14 л промывание клеток прекращают.
Прошедшую через фильтр жидкость, содержащую соединения молекулярной массы 500 кД (приблизительно 14 литров из каждого ферментера), концентрируют с помощью двух фильтров A/G Technology (UFP-10-C-4XTCA) с полым волокном диаметром 0,5 мм, удаляющим соединения молекулярной массы 10000 (10 кД), концы которых соединены друг с другом. Используют тот же способ прокачивания с рециклингом концентрата за исключением того, что прошедшую через фильтр жидкость удаляют. Конечный концентрат объемом приблизительно 500 мл из каждого ферментера сохраняют для следующей стадии обработки.
ПРИМЕР 4 Дальнейшая очистка и концентрирование фермента PI-PLC
Концентрат, полученный при ультрафильтрации с фильтром 10 кД (см. Пример 3), выделенный из каждой ферментации Bacillus cereus, доводят до 80% насыщения сульфатом аммония и перемешивают на льду в течение 60 минут. Раствор центрифугируют в течение 15 минут при скорости 600 об/мин с использованием ротора Sorvall GSA. Супернатант отбрасывают и осадок растворяют в минимальном объеме 10 мМ Трис-HCl, 0,2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоте) (рН 7,5), а затем диализуют на холоде против того же самого буфера.
Содержание белка в каждом концентрате измеряют, используя анализ со связыванием красителя (BioRad) и уровень PI-PLC измеряют (см. статью Hendrlckson и соавт., Bioorg. Med. Chem. Letters, 1: 619-622,(1991)), используя способ детекции на основе ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) и флуоресцентный субстрат (Molecular Probes, Inc., P-3764, 1-пиренбутил-мио-инозит-1-фосфат, литиевая соль). В Таблице 1 ниже суммируют данные анализа и предсказывают приблизительную чистоту и общее количество фермента на основе чистоты, полученной для каждого из четырех препаратов. Препараты фермента хранят в замороженном виде при -20°С для дальнейшей обработки.
Итоги анализа неочищенных препаратов фермента PI-PLC
ПРИМЕР 5 Объединение и концентрирование ферментных препаратов перед применением в корме для животных
Ферментные препараты 1, 2, 3 и 4 объединяют с получением общего объема 675 мл, медленно добавляют сульфат аммония (492 г) и перемешивают раствор на льду в течение нескольких минут. Раствор центрифугируют для того, чтобы собрать осадок. Фракцию осадка растворяют в минимальном количестве 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,0).
Объем полученного раствора составляет 70,9 мл при плотности 1,057 г/см3. Измерение концентрации белка дает результат приблизительно на уровне 25,5 мг/мл. Измерение активности PI-PLC дает результат приблизительно на уровне 1,13 ед./мг при оценке чистоты PI-PLC на уровне 1,88%. Раствор замораживают при -20°С в имеющемся виде, затем оттаивают и используют для равномерной обработки 200 фунтов (90,72 кг) корма для кур.
ПРИМЕР 6 Клонирование и экспрессия гена PI-PLC Bacillus ceresus в Bacillus megaterium
Секвенируют ген, кодирующий фосфатидилинозит-специфическую фосфолипазу С (PI-PLC). См. статью Кирре и соавт., J. Bacteriol., 171: 6077-6083, (1989). Ген PI-PLC клонируют из хромосомной ДНК Bacillus cereus (АТСС 6464) при использовании технологии ПЦР (полимеразной цепной реакции). Для Bacillus megaterium используют экспрессионный вектор pMEGA (BIO 101, Vista, CA). Конструируют два ПЦР-праймера, а именно: 5'-GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3' (праймер 1) и 5'-CGGGATCCATATTGTTGGTTATTGG-3' (праймер 2) с сайтом Spel в праймере 1 и сайтом BamHI в праймере-2.
Амплифицированный с помощью ПЦР ген PI-PLC лигируют в сайт Spel-BamHI pMEGA и получают плазмиду pCG682. Белок PI-PLC сливают с первыми тремя аминокислотами продукта гена xylA в сайте Spel экспрессионного вектора. Экспрессия гена PI-PLC происходит под контролем промотора xylA. Для оценки продукции фосфатидилинозит-специфической фосфолипазы С в Bacillus megaterium используют ферментацию в качалочных колбах. Бульон LB с добавлением 10 мкг/мл тетрациклина (20 мл) инокулируют 0,2 мл посевной культуры и инкубируют на качалке при 37°С при скорости 250 об/мин. При OD600, равном приблизительно 0,5, добавляют 5 г/л D-(+)-ксилозы с целью индукции промотора xylA. Через три часа супернатант получают путем центрифугирования. Активность фосфатидилинозит-специфической фосфолипазы С измеряют способом с применением флуоресцентного субстрата (см. статьи Hendrickson и соавт., Biochemistry, 31: 12169-12172, (1992); Hendrickson, Anal. Biochem., 219: 1-8, (1994)), используя субстрат с 1-пиренбутил-мио-инозит-1-фосфатом (Molecular Probes, Eugene, OR) и детекции с помощью ВЭЖХ.
Измерение экспрессии PI-PLC
Данные результаты показывают, что большая часть PI-PLC является экстрацеллюларной и что экспрессия происходит только после добавления D(+)-ксилозы (Таблица 2). Данный рекомбинантный штамм оценивают как имеющий продуктивность, превышающую по меньшей мере в 15 раз (мг/л/OD) продуктивность среднего дикого штамма в том виде, как его выращивают в Примере 2.
ПРИМЕР 7 Ферментация В. megaterium с целью продукции PI-PLC
В. megaterium/pCG6S2, описанный в Примере 6, используют для получения PI-PLC посредством ферментации. Среда (РМ) для посевных и ферментационных стадий изначально содержит 20 г/л Amberferm 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 г/л дрожжевого экстракта Amberex 695 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 г/л NZ Case Plus (Quest International, Hoffman Estates, IL), 2,0 г/л К2НРО4, 0,1 г/л MgSO4×7Н2О и 2,0 г/л глюкозы, а также 12,5 мг/л тетрациклина. Значение рН подводят до 7,5.
Стадию получения посевного материала (500 мл в круглодонной колбе объемом 2,8 л) начинают с инокуляции из флакона с замороженным посевным материалом и встряхивания колбы при 250 об/мин при 30°С. Флаконы с посевным материалом готовят путем введения одной колонии, выращенной на чашке с агаризованной средой LB, в 20 мл среды РМ в качалочной колбе объемом 250 мл. После выращивания до OD600 приблизительно 1,0 при 30°С добавляют 5 мл 50% стерильного глицерина, перемешивают, вносят раствор в пластиковые стерильные флаконы объемом 2 мл и замораживают при -60°С.
После выращивания до OD600 нм приблизительно от 1,2 до 1,8 используют посевные колбы объемом 500 мл через 9 часов встряхивания. Для засева 60-литрового ферментера, наполненного 50 л той же самой среды, стерилизованной паром, используют две колбы. Тетрациклин стерилизуют фильтрацией (фильтр 0,2 мкм) и добавляют после стерилизации и охлаждения до 30°С в виде 1% раствора в 40% этаноле. В ферментеры вводят 0,1 мл/л пеногасителя Mazu DF10PMOD11 (BASF, Gumee, IL) в исходную загрузку и добавляют по мере необходимости для контроля пенообразования во время ферментации. Условия работы для первой стадии получения посевного материала в ферментерах являются следующими: давление 0,5-2,5 фунт/дюйм2 (3,45-17,24 кПа); температура 30±0,5°С; скорость перемешивания 200-450 об/мин.; барботаж воздуха 25-50 SLPM (об/мин); растворенный кислород ≥25%. Значение рН контролируют на уровне 6,9-8,1, используя 21,25% Н3РО4 или 5н. NaOH. После использования исходного количества глюкозы к 5 часам ферментации и достижения OD600 приблизительно 17 начинают подпитку ксилозой (предварительно стерилизованной автоклавированием при 121°С в течение 20 минут и состоящей из 10 кг D-(+)-ксилозы и 10 литров воды). D-ксилозу получают в фирме Varsal Instruments, New Jersey. Подпитку изначально начинают с 25 мл/мин и продолжают в течение 1,5 часов, затем увеличивают до 43 мл/мин. Процесс со второй скоростью продолжают до тех пор, пока не израсходуют все 22,5 л ксилозной подпитки. Уровень растворенного кислорода поддерживают путем повышения барботирования воздуха от 50 до 500 SLPM. Когда поток воздуха составляет 500 SLPM, повышают скорость (об/мин). Процесс ферментации завершают через 20 часов. К 17 часам накапливается 7440 ед/л (единицы, как указано в Примере 4).
Ферментационный бульон собирают при использовании Pall Filtron C10 Skid и четырех модулей CellFlo Microgon (мембраны с порами 0,2 мкм, диаметр волокон 1 мм при 3,3 м2). Растворенное вещество, проходящее через мембрану 0,2 мкм, концентрируют, используя LT100 Pall Filtron Skid с мембраной для ультрафильтрации AG/Technologies Size 85 10 К. Конечный концентрат объемом 10 л замораживают при -20°С.
ПРИМЕР 8 Ферментационный бульон Bacillus cereus не обладает антибиотической активностью
Ферментацию с Bacillus cereus (ATCC 7004) ведут в соответствии со способом, описанным в Примере 2, за исключением того, что исходный объем увеличивают до 20 л. Тест на присутствие антибиотика проводят с Е. coli MG1655 в качестве тест-штамма с использованием конечного ферментационного бульона или частично очищенного PI-PLC, приготовленного согласно способу, описанному в Примерах 3-5. Тест проводят как анализ на чашках с цилиндрами. См. статью Brantner, Pharmazie, 52(1): 34-40, (1997). Вокруг цилиндров, содержащих образцы фермента, не наблюдают никакие зоны, в которых отсутствует рост (чистые зоны), указывающие на антибиотическую активность.
ПРИМЕР 9 Анализ PI-PLC с использованием флуоресцентного способа на платах для микротитрования
Разработан биохимический тест на PI-PLC, усовершенствованный относительно способа, предложенного в работе Hendrickson и соавт. (supra), использованный в Примере 4. Субстрат, N-метил-морфолиновую соль 4-метилумбеллиферил-мио-инозит-1-фосфата, приобретают в фирме Biosynth (Napervllle, Illinois). Реакции мониторируют с помощью флуоресцентного ридера для плат для микротитрования Flouroscan II, приобретенного в фирме МТХ Lab Systems (Vienna, Virginia). Для анализов ферментационного бульона или концентратов фермента проводят реакции 200 мкл в черных пластиковых платах для микротитрования, содержащих 10 мМ Трис-HCl, 0,16% дезоксихолата, 0,8 мМ N-метил-морфолиновой соли 4-метилумбеллиферил-мио-инозит-1-фосфата и разведенный фермент при рН 8,0. Разведения фермента при необходимости делают в 0,1% растворе BSA (бычий сывороточный альбумин) в воде. Реакцию проводят при 37°С в течение 30 минут при чтении в интервалами 2 минуты с целью наблюдения выхода метилумеллиферона из субстрата при возбуждении при 350 нм и эмиссии при 450 нм.
Для расчета числа образующихся единиц (мкмоль/мин)/количество добавленного раствора фермента используют корреляцию единиц флуоресценции и микромолей метилумбеллиферона. Проведение реакции при рН 8,0 является компромиссом между значением рН, оптимальным для фермента, и значением рН максимальной флуоресценции метилумбеллиферона (рН 10). Кроме того, при рН 9,0 и выше становится значительной скорость неферментативного выхода метилумбеллиферона. В данных условиях реакции специфическая активность (ед./мг) приблизительно в 39,3 раза превышает активность, полученную при использовании способа, описанного в статье Hendrickson и соавт. (supra). С целью эффективности тестирования в экспериментах с кормлением животных единицы, измеренные с использованием данного способа анализа, превращают в единицы, эквивалентные единицам Hendrickson, с целью облегчения сравнения с первыми тестами, проведенными до использования данного анализа.
ПРИМЕР 10 Анализ PI-PLC, добавляемого в эффективных дозах в корма для животных
Более чувствительный вариант анализа PI-PLC на основе N-метил-морфолиновой соли 4-метилумбеллиферил-мио-инозит-1-фосфата (Пример 9) разрабатывают для измерения количества фермента после добавления в корм для животных, который имеет одно значение рН для анализа и другое значение рН для измерения флуоресценции. Фермент экстрагируют из тест-материалов корма путем взвешивания 4 г корма и добавления навески к 20 мл 10 мМ Трис-Cl (рН 7,5) с 0,1% дезоксихолата для получения концентрации корма 20 г/л. Суспензию перемешивают на качалке NBS G-25 (New Brunswick Scientific) в течение 1 часа при комнатной температуре при скорости 250 об/мин. Суспензию центрифугируют при 13000 об/мин в микроцентрифуге IEC Micromax с использованием пробирок для микроцентрифугирования объемом 1,5 мл. Соответствующие разведения экстрактов делают в 0,1% BSA (бычьем сывороточном альбумине). Образцы, экстрагированные из кормов с добавлением 10 ед./фунт (0,022 ед./г), не разводят.
Первая стадия реакции - Пробирки готовят следующим образом. Следует также включить стандарты 0,12 ед./мл PI-PLC (единица, как описано в Примере 4) в разведении 1:100 или 1:200 и контрольную пробу без фермента ("пустышку"). Образцы для проведения реакций должны быть покрыты фольгой для защиты субстрата от света.
20 мкл TrIs-HCl, 0,10 М, рН 6,0
40 мкл Дезоксихолата (0,8%)
40 мкл субстрата PI-PLC (4 мМ)
100 мкл фермента
200 мкл / пробирку - общий объем реакционной смеси при 25°С.
Для отбора 0,10 мкл из каждой реакционной смеси используют две точки времени (30 и 60 мин). Аликвоты нагревают при 65°С в течение 15 минут, чтобы остановить реакцию фермента, и охлаждают на льду. Наконец, образцы центрифугируют при 12000 об/мин в микроцентрифуге в течение 5 минут.
Чтение на флуориметре - Используют 120 мкл 0,10 М Трис-буфера. Трис-буфер добавляют в лунку черной пластиковой платы для микротитрования, затем перед чтением добавляют 80 мкл образца реакционной смеси, как описано в Примере 7. Уровни фонового контроля вычитают. Вычисляют скорость образования единиц флуоресценции/минуту. Единицы флуоресценции переводят в микромоли продукта реакции и вычисляют количество единиц экстрагированного фермента/исходный фунт (или г) корма.
ПРИМЕР 11 Опыты кормления кур при контрольном заражении патогеном
I. Опыт I по кормлению цыплят-бройлеров
Первый опыт по кормлению проводят, начиная с однодневных петушков-бройлеров. Разрабатывают обычный однородный корм для цыплят в виде мешанки типа кормов для начального периода откорма, соответствующий или превышающий требования "Рекомендаций по кормам для птицы" Национального исследовательского совета (National Research Council's Nutrient Requirements for Poultry) (9 изд., 1994) и скармливают его. Цыплят рассаживают по клеткам (размером 30,5 см × 61 см2 площадь пола) в соответствии с четырьмя группами лечения, при том, что каждая группа лечения имеет четыре повторности и повторности по 6 птиц/клетку (см. Таблицу 3). Воду и корм дают без ограничений в течение 21 дня периода тестирования. Для распределения цыплят по клеткам и клеток по группам используют схему рандомизированных повторений. Все клетки, кормушки и поилки дезинфицируют перед началом теста. Используют постоянное освещение (24 часа/день) лампами накаливания. Массу тела измеряют в первый день и 21 день. Потребление корма измеряют в день 21.
На 5 день всех цыплят инфицируют 200000 ооцистами Eimeria acervulina/птицу путем перорального введения. На 7 день всех птиц еще раз инфицируют 500000 Clostridium perfringens через воду для питья. В отрицательном контроле (Т1) инфекцию не лечат. В положительном контроле (Т2) в корм добавляют кокцидиостатик и антибиотик. Лечение осуществляют с помощью антикокцидиозного препарата Сакокс (Sacox) (салиномицин в концентрации 60 г/т) и антибиотика BMD-50 (50 г/т). В группах лечения Т3 и Т4 используют корм, обработанный ферментом PI-PLC дикого типа (приблизительно 0,34 г PI-PLC по чистому веществу), начиная с пятого дня со времени перорального введения Eimeria acervulina. Весь корм готовят в виде одной однородной загрузки, затем делят для добавления антибиотика (тест-группа Т2) или фермента (тест-группы Т3 и Т4). Результаты анализа массы тела птиц представляют в Таблице 4 и вычисления соотношения корм/прибавление массы тела представляют в Таблице 5.
Опыт I по экпериментальному лечению путем кормления цыплят-бройлеров
Средняя масса тела (г) на 21 день
Среднее усвоение корма (дни 0-21) с поправкой на массу погибших птиц
В обеих предшествующих таблицах средние значения в ряду без строчной буквы являются значимо различными (Р<0,05) по тесту значимости Дункана.
II. Опыт II кормления цыплят-бройлеров
Проводят второй опыт по кормлению однодневных петушков-бройлеров. Базовые корма разрабатывают таким образом, что они превышают требования "Рекомендаций по кормам для птицы" Национального исследовательского совета (National Research Council's Nutrient Requirements for Poultry) (9 изд., 1994), и их готовят в форме мешанки для обеспечения однородности. Исследование проводят с использованием рандомизированных батарей клеток слепым методом с целью тестирования эффекта PI-PLC, полученной из природного источника, Bacillus cereus (PI-PLC дикого типа), или рекомбинантного Bacillus megaterium на показатели петушка-бройлера, достигнутые в возрасте 21 суток. Природный источник содержит также другие экстрацеллюларные ферменты, но PI-PLC, полученная из Bacillus megaterium, имеет высокую чистоту, и, кроме того, ее очищают ультрафильтрацией при использовании мембраны NMWC 30 кД. Птиц заражают в возрасте 8 суток птичьими кокцидиями (200000 ооцист Е. acervulina/птицу через питьевую воду) и в возрасте 10 суток - Clostridium perfringens (100000/птицу через питьевую воду). Каждый из девяти способов лечения проводят в 10 повторностях или клетках. В каждой клетке содержат 6 вакцинированных от ньюкаслской болезни, бронхита и болезни Марека (Newcastle-Bronchitis, Mareks) петушков-бройлеров Cobb×Cobb при площади 0,40 фут2 (371,6 см2)/птицу. Погибших птиц, если они имеются, не заменяют после 8 дня. Корм дают в виде мешанки и без ограничения во весь тест-период опыта (с 0 до 21 дня).
Все птицы в дни 0-7 получают рацион в виде обычной и необработанной базовой мешанки, не содержащей антибиотики. После этого птицам в возрасте 8-21 суток скармливают девять обработанных рационов в форме мешанки. Базовый корм представляет собой обычный корм для начального периода откорма бройлеров, содержащий 22% неочищенного белка с ME (содержание обменной (метаболической) энергии) 1400 ккал/фунт (3090,5 ккал/кг).
Опыт II по экспериментальному лечению путем кормления цыплят-бройлеров
Опыт II по кормлению цыплят-бройлеров
В первом опыте, когда бактериальную инфекцию вводят через питьевую воду (Пример 11-I), PI-PLC дикого типа, образуемая Bacillus cereus по всем критериям действует настолько же хорошо или лучше, чем лечение комбинацией салиномицина и BMD (Таблицы 4-5). В последующем приведенном выше тесте с использованием рекомбинантной PI-PLC (Пример 11-II, Таблица 7) PI-PLC, добавленная в различных концентрациях, показывает доза-зависимый эффект на снижение числа кишечных повреждений и усвоение корма (Т3-Т6) и повышение набора массы. Кроме того, лечение рекомбинантной PI-PLC в дозе 90 ед./фунт (198,45 ед./кг) в отсутствие лечения комбинацией салиномицина и BMD снижает число повреждений кишечника и обладает положительным эффектом в плане усвоения корма и прибавления массы тела. В данном тесте PI-PLC дикого типа из Bacillus действует не так эффективно, как ее рекомбинантный вариант в такой же концентрации (10 ед./фунт, 22,05 ед./кг).
III. Опыт III по кормлению цыплят-бройлеров ферментами PI-PLC и эндо-1,4-β-D-маннаназой
Исследование проводят в рандомизированной батарее клеток Petersime с целью тестирования эффекта PI-PLC и эндо-1,4-β-D-маннаназы (см. Патент США 5429828) на показатели петушка-бройлера, достигнутые в возрасте 21 суток. Птиц заражают в возрасте 8 суток птичьими кокцидиями (75000 ооцист Е. acervulina и 1250 Е. maxima/птицу путем перорального введения) и в возрасте 11, 12 и 13 суток - Clostridium perfringens (ежедневное пероральное введение в 1 мл свежего культурального бульона, содержащего 108 КОЕ (колониеобразующих единиц)/мл). Каждый способ лечения (Таблица 8) представлен 8 повторностями или клетками и в каждой клетке содержат 14 вакцинированных от болезни Марека петушков-бройлеров Cobb×Cobb (число птиц уменьшают до 10 в день 14, поскольку из каждой клетки удаляют 4 птиц и подсчитывают повреждения) при площади 0,36 фут2 (350 см2)/птицу. Погибших птиц удаляют из клеток при обнаружении, но не заменяют. Корм дают в виде мешанки без ограничения во весь тест-период опыта (с 0 до 21 дня).
Птицам в возрасте 0-21 суток скармливают рацион в виде мешанки. Базовый корм представляет собой обычный корм для начального периода откорма бройлеров, содержащий 22% неочищенного белка с ME 1400 ккал/фунт (3090,5 ккал/кг).
Опыт III по экпериментальному лечению путем кормления цыплят-бройлеров
Потребление корма подбирают для получения разницы средних масс птиц с целью сравнения способов лечения. Инфекцию усугубляют AF/G (масса тела, подобранная путем усвоения корма) на приблизительно 23% (0,147 единиц AF/G). Применение салиномицина и BMD полностью восстанавливают AF/G до нормальных уровней, но данные два химических агента не превосходят комбинацию D-маннаназы и PI-PLC в уменьшении кишечных повреждений, вызываемых инфекцией. Введение ста миллионов (100 Мед.) единиц D-маннаназы/тонну, либо в виде монокомпонента, либо в комбинации с PI-PLC преодолевает вредные последствия инфекции, что доказывают по 65-70% улучшению в снижении AF/G, имеющемуся в инфицированном контроле (см. Т3 относительно Т1). Полагают, что D-маннаназа снижает число кишечных повреждений, вызываемых Е. acervulina, в большей степени, чем вызываемых Е. maxima. Достигают частичного восстановления AF/G у инфицированных птиц, леченных PI-PLC, введенной в корм, но преодолевают только 33-41% ухудшения. Однако оба класса PI-PLC снижают число кишечных повреждений, вызываемых любым из видов Eimeria. В случае E. maxima снижение уровня повреждений является статистически значимым. Результаты представляют в Таблице 9.
Опыт III по кормлению цыплят-бройлеров с добавлением PI-PLC и эндо-1,4-β-D-маннаназы, которые скармливают цыплятам, инфицированным Е. acervulina, Е. maxima и С. perfringens
IV. Опыт IV по кормлению цыплят-бройлеров
Исследование проводят в рандомизированной батарее клеток Petersime с целью тестирования эффекта PI-PLC, маннаназы и грибного фермента маннаназы на показатели петушка-бройлера, достигнутые в возрасте 21 суток. Птиц заражают в возрасте 8 суток птичьими кокцидиями (75000 ооцист Е. acervulina и 1250 ооцист E. maxima/птицу путем перорального введения) и в возрасте 11, 12 и 13 суток - Clostridium perfringens (ежедневное пероральное введение в 1 мл свежего культурального бульона, содержащего 108 КОЕ/мл). Каждый способ лечения представлен 8 повторностями или клетками. Каждая клетка изначально содержат 14 вакцинированных от болезни Марека петушков-бройлеров Cobb×Cobb (число птиц уменьшают до 10 в день 14, поскольку из каждой клетки удаляют 4 птиц и подсчитывают повреждения) при площади 0,36 фут2 (350 см2/птицу. Птиц не заменяют. Корм и воду дают без ограничения во весь тест-период опыта (с 0 до 21 дня). Птицам в возрасте 0-21 суток скармливают рацион в виде мешанки. Базовый корм для способов лечения 1-16 представляет собой обычный кукурузно-соевый корм для начального периода откорма бройлеров, содержащий 22% неочищенного белка с ME 1400 ккал/фунт (3090,5 ккал/кг).
Результаты, суммированные в Таблице 10 ниже, демонстрируют воспроизводимый положительный эффект добавления либо PI-PLC, либо маннаназы в корма для цыплят-бройлеров, инфицированных двумя видами птичьих кокцидий и Clostridium perfringenes, вызывая улучшение в плане как набора массы тела, так и усвоения корма. Важно, что данное исследование показывает, что как PI-PLC, так и маннаназа в комбинации с салиномицином, но без добавления антибиотика BMD (тесты 6 и 5) восстанавливает показатели до базового уровня, показанного в тестах с отсутствием инфекции (No 1 и 2). Данный эффект служит доказательством антибактериальной функции. В данном случае комбинация PI-PLC/салиномицина действует несколько лучше, чем маннаназа, и превышает даже используемое в современной практике в США добавление комбинации BMD и салиномицина для инфицированных стад птиц (Тест 4).
Опыт IV по кормлению цыплят-бройлеров
ПРИМЕР 12 Определение эффекта ферментов на выживаемость и клеточную инвазию спорозоитов Eimeria acervulina и Eimeria tenella in vitro
Спорозоиты Eimeria acervulina или спорозоиты Eimeria tenella и культивируемые клетки почки молодого хомячка (ВНК) получают при использовании опубликованных способов. См. статью Augustine, Avian and Poultry Biology Reviews, 11: 113-122, (2000). Для предварительной обработки клеток культуры клеток покрывают разведением ферментов, как описано в Таблице 11, и исследуют на наличие морфологических изменений в течение 5-45 минут после покрытия. Через 45 минут монослойные культуры дважды промывают, затем инокулируют необработанными спорозоитами Е. acervulina или Е. tenella. Для применения при инфекции спорозоиты суспендируют в подходящем разведении фермента и немедленно инокулируют ими клеточные культуры. После инкубирования в течение 45 минут культуры фиксируют, окрашивают и количественно оценивают инвазию.
Наблюдения делают, просматривая изменения в макроскопической морфологии спорозоитов или клеток вследствие обработки ферментом. На уровнях фермента, используемых в данных экспериментах, морфологические изменения не отмечают. Инвазию спорозоитов культивируемых клеток измеряют после обработки ферментом двумя способами, а также без обработки ферментом путем гистологического окрашивания и микроскопирования. См. статью Augustine, supra.
Данные в Таблице 11 показывают значимые уменьшения инвазии спорозоитов при инвазии спорозоитов как Е. acervulina, так и Е. tenella. Оба, как относительно неочищенный препарат фермента PI-PLC из экстрацеллюларного бульона В. cereus, так и высокоочищенный рекомбинантный PI-PLC, образующийся в бульоне рекомбинантного В. megaterium, приводят к статистически значимому снижению инвазии в большинстве экспериментов. Даже в дозе, равной приблизительно половине дозы препарата дикого типа PI-PLC из В. cereus, препарат рекомбинантного PI-PLC еще является активным. Таким образом, предварительная обработка клеток ферментом и удаление фермента промыванием является эффективным, как и одновременное добавление фермента при инфекции. Однако, основываясь на опыте экстракции фермента из корма, можно сказать, что две стадии промывания, вероятно, не удаляют весь фермент.
Препарат фермента с эндо-1,4-β-D-маннаназой также вызывает статистически значимое снижение инвазии в двух экспериментах, где клетки предварительно перед инфекцией обрабатывают ферментом. Данные положительные результаты включают один эксперимент с каждым типом патогена. Вследствие этого маннаназа также представляет собой, как и PI-PLC из В. cereus, препарат для снижения инвазии спорозоитов in vitro.
Инвазия in vitro клеток ВНК спорозоитами Eimeria acervulina или Eimeria tenella с обработками ферментами или без них
ПРИМЕР 13 Оценка in vitro PI-PLC в отношении инфекции Cryptosporidium
Фермент PI-PLC оценивают на антикриптоспоридиальную активность и токсичность в концентрациях, лежащих в интервале 0,001-30 ед./мл, с использованием 4-дневных клеток почек лошади Madin-Darby (MDCK). Единицы фермента определяют способом, описанным в Примере 4, но измеряют, как в Примере 9. Используемый препарат фермента получают из рекомбинантного Bacillus megaterium. Обработку начинают через 3 часа после инфекции и продолжают в течение 48 часов.
Хемолюминесцентный иммуноанализ. Перед инфекцией ооцисты промывают и ресуспендируют в базовом DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) с добавлением 0,75% таурохолата натрия и инкубируют в течение 10 минут при 37°С (см. статьи You и соавт., FEMS Microbiol. Letters, 136: 251-256, (1996); You и соавт., J. Antimicrobial. Chemother., 41: 293-296, (1998)). Среду для эксцистирования (выхода из цисты) разводят средой Ultraculture, быстро разливают на чашки, содержащие клетки MDCK с конфлюэнтностью 100%, и поддерживают в среде Ultraculture в течение 4 дней. Инокулюм инкубируют с клетками в течение 3 часов перед промыванием PBS и заменяют свежей средой Ultraculture, содержащей или не содержащей тест-фермент. Чашки инкубируют при 37°С в воздушной атмосфере с содержанием 5% СО2 в течение 48 часов. Культуры промывают PBS и фиксируют раствором Bouin.
Фиксированные чашки промывают буфером TBST (20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 0,05% Твин-20) и блокируют 1% BSA-TBST (буфер TBST, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина) в течение 30 минут при 25°С при осторожном встряхивании. Сыворотку кролика против Cryptosporidium parvum (разведение 1:200) наносят на чашки и инкубируют в течение 1 часа. После промывания TBST образцы последовательно инкубируют с меченными биотином козьими IgG против кролика и меченными пероксидазой хрена стрептавидином (рабочее разведение 1:1000, KPL Inc., Gaithersburg, MD). В качестве субстрата используют усиленный люминол (4-иодофенол и пероксид водорода, Aldrich Chemical Co. Inc., Milwaukee, Wl). Чашки читают с помощью люминометра ML3000 (Dynatech Lab., Chantilly, VA) и определяют относительные световые единицы (RLU). Средние значения RLU вычисляют по 4 повторяющимся лункам и все эксперименты повторяют по меньшей мере дважды.
Анализ на токсичность. Фермент тестируют, используя анализ восстановления коммерческого тетразолиевого красителя (CellTiter 96; Promega Corp., Madison, Wl, USA). Вкратце, каждый фермент в нижеуказанной концентрации вводят в 96-луночные платы, содержащие монослои конфлюэнтных клеток MDCK. Каждое разведение оценивают в тройной повторности. Фермент инкубируют на монослоях при 37°С при содержании 5% СО2. Через 48 часов платы проявляют в течение 1 часа и читают с использованием ридера для плат ELISA при 490 нм. Результаты регистрируют и анализируют. Процент токсичности вычисляют путем вычитания среднего значения OD контрольной среды без фермента из среднего значения OD с использованием фермента и затем деления на OD среды и умножения на 100. Определяют значения цитотоксичности, как указано в следующей таблице.
Значительную токсичность наблюдают при концентрации 3 ед./мл или при более высокой концентрации фермента. При использовании данного фермента никакую значительную токсичность не отмечают в интервале концентраций 0,1-1 ед./мл (см. Таблицу 12). Вследствие этого проводят серию экспериментов в данном интервале концентраций (1,0 ед./мл или ниже) для определения активности фермента и специфичности фермента. В первом эксперименте клетки MDCK инфицируют эксцистированными спорозоитами. После инкубирования в течение 3 часов клеточный монослой промывают и добавляют фермент в различных концентрациях на период 48 часов. Как показывают в Таблице 13, фермент проявляет антикриптоспоридиальную активность в интервале 0,01-1 ед./мл in vitro. Достигают приблизительно 50% ингибирования при концентрации 0,1 ед./мл (см. чертеж).
Токсичность рекомбинантной PI-PLC, полученной в В. megaterium, в отношении монослойных культур клеток MDCK
Активность рекомбинантного фермента PI-PLC в отношении клеточных культур MDCK, инфицированных С. parvum
CL - летальная концентрация
Вторую серию экспериментов проводят с целью оценки специфичности фермента. Спорозоиты обрабатывают ферментом в различных концентрациях в течение 45 минут и быстро промывают. Затем обработанным спорозоитам позволяют инфицировать необработанные клетки-хозяева, развиваться и размножаться в течение 48 часов. В отдельном эксперименте клетки-хозяева инкубируют с ферментом в различных концентрациях, промывают и инфицируют необработанными спорозоитами. Как показано ниже (см. Таблицу 14), обработка либо спорозоитов, либо клеток-хозяев ферментом приводит к частичному ингибированию. В данном интервале концентраций доза-зависимое ингибирование не наблюдают. Это может быть обусловлено коротким периодом инкубирования фермента с клетками хозяина или паразита (45 мин) или частичным или полным расщеплением рецепторов хозяина/паразита. Кроме того, другие рецепторы хозяина/паразита, возможно, участвуют в инфекции и влияют на рост, отмечаемый в клетках-хозяевах.
Прединфекционная обработка спорозоитов или клеток MDCK и эффект инфекционности С. parvum
ПРИМЕР 14. Оценка PI-PLC in vivo в отношении инфекции Cryptosporidium
Фермент оценивают на антикриптоспоридиальную эффективность с использованием модели на мышах с иммунодефицитом SCID. Вкратце, инокулюмы ооцист готовят путем промывания очищенных ооцист (хранение < 6 месяцев) 0,1% BSA, PBS (рН 7,2) с целью удаления бихромата калия. Мышей SCID (в возрасте 4-5 недель) инфицируют 106 ооцист (штамм IOWA) и лечат, как указано ниже. У мышей собирают образцы фекалий, очищают в скачкообразных концентрациях сахарозы и оценивают на нагрузку паразита путем проточной цитометрии, как описано ранее. См. статью Arrowwood и соавт., J. Parasitol., 81: 404-409, (1995).
Схема лечения в терапевтических экспериментах
Гранулированный корм для мышей покрывают либо 30, либо 90 ед./фунт (66,15 и 198,45 ед./кг соответственно) PI-PLC в PBS. Все мыши получают корм без ограничений. Мыши получают корм сразу после инфекции. Образцы фекалий и данные по массе тела собирают два раза в неделю. Потребление корма измеряют ежедневно. Мышей безболезненно умерщвляют путем инъекции каждой мыши 0,2 см3 раствора кетамина в концентрации 100 мг/мл, ксилазина в концентрации 100 мг/мл и 0,9% NaCl.
Средние значение по потреблению корма/день/мышь и средние значения массы тела мышей представлены в Таблице 16. Не наблюдают никакой статистически значимой разницы в потреблении корма и массе тела в течение 3 недель.
Потребление корма и прибавление массы тела у мышей
Эффективность в течение 3 недель после инфекции. Образцы фекалий собирают в сроки 3, 4 и 4, 5 недели после инфекции и число Cryptosporidium в образцах по 100 мкл измеряют у мышей SCID в леченых и контрольных группах, как показано в Таблице 17. Как можно видеть, мыши, леченные ферментом, демонстрируют снижение нагрузки паразита. В леченых группах наблюдают нагрузки паразита (34-54%). Некоторые из данных снижений являются статистически значимыми при оценке с использованием статистического анализа ANOVA (показано ниже и отмечено знаком). Фермент проявляет потенциал как антикриптоспоридиальный терапевтический агент. Более высокие дозы фермента или улучшенная доставка фермента в область инфекции могла бы повысить эффективность и может быть предложена для будущих экспериментов.
Эффективность PI-PLC in vivo в плане снижения Cryptosporidium в фекалиях
ПРИМЕР 15 Проверка фермента в кормах, использованных в тестах на рост
Анализ PI-PLC, экстрагированного из кормов, использованных в вышеописанных опытах на животных, проводят, как описано в Примере 10. Результаты суммированы в Таблицах 18-19.
Исследование Cryptosporidium, корм для мышей
Эффективность экстракции из корма значительно изменяется в зависимости от типа корма. Экстракция из корма для мышей показывает эффективность 73,4-76% (см. Таблицу 18). Три различных препарата корма для цыплят, приготовленных в трех различных местах, тщательно нагружают 45 или 180 ед./фунт (99,34 или 397,35 ед./кг соответственно) рекомбинантной PI-PLC, затем сразу экстрагируют и анализируют при использовании процедуры анализа, соответствующей Примеру 9, поскольку уровень нагрузки находится в интервале способа непрерывного анализа, описанного в Примере 9 (Таблица 19).
Тестирование эффективности экстракции из различных источников корма для цыплят и кукурузной муки
Можно видеть, что эффективность экстракции из кукурузной муки близка к экстракции из корма для мышей. Однако экстракция из некоторых образцов корма для цыплят в данном эксперименте, а также и в других является низкой.
В тесте, как показано в Таблице 20, экстрагируемый фермент составляет приблизительно 30-45% от теоретического содержания PI-PLC, тогда как β-маннаназа хорошо экстрагируется и выход составляет приблизительно 100%. Экстракция на уровне приблизительно 45% представляет собой наилучший уровень экстракции, наблюдаемый с использованием данного корма при тесте на экстракцию, приведенном выше. Таким образом, результаты анализа для ед./фунт, экстрагированных из кормов, тестирование которых приведено в Таблице 20, находятся в интервале, предполагаемом для использованной нагрузки.
Проверка нагрузки фермента в опыте III по кормлению цыплят-бройлеров
Поскольку ряд репрезентативных вариантов осуществления и деталей показан с целью иллюстрации изобретения, для компетентных специалистов в данной области будет очевидно, что, не выходя из объема притязаний изобретения, могут быть сделаны различные изменения и модификации.
Изобретение относится к области ветеринарии и кормления животных. Композиция содержит эстеразу-фосфолипазу или гемицеллюлазу и физиологически приемлемый носитель. Способ лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта заключается в пероральном введении указанных ферментов или применение ферментов или пероральных лекарственных форм ферментов в качестве средства для лечения заболеваний пищеварительного тракта. 8 н. и 64 з.п. ф-лы, 1 ил., 20 табл.
вызвана бактериальным патогеном из рода Clostridium.
| WO 9741739 А, 13.11.1997 | |||
| КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ КИШЕЧНОЙ ИНФЕКЦИИ, СПОСОБ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ ИМVУННОЙ СИСТЕМЫ, СПОСОБ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО МАТЕРИАЛА В ВЕРХНИЕ ОТДЕЛЫ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА | 1992 |
|
RU2113220C1 |
