СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННОЙ АЛЛЕРГЕНОМ АКТИВАЦИИ БАЗОФИЛОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К НЕКОТОРЫМ ВЕЩЕСТВАМ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 G01N33/68 

Область изобретения

Изобретение касается способа определения ответа базофилов в крови пациента после стимуляции аллергеном с целью определения гиперчувствительности к некоторым веществам с помощью двойного мечения.

Предпосылки изобретения

Для определения гиперчувствительности организма к некоторым веществам используются либо тесты in vivo (кожные тесты, двойное спелое испытание), либо тесты in vitro. В настоящее время преобладают тесты in vitro, таким образом избегают аллергенной нагрузки на пациента. Другими аргументами в пользу тестов in vitro являются возраст пациента, вероятность возникновения реакции гиперчувствительности, комфортное состояние пациента (в отличие от кожных уколов, где один укол соответствует определению одного аллергена, тесты in vitro делают возможным определение нескольких аллергенов после однократного взятия крови).

В настоящее время наиболее широко используемым тестом in vitro является измерение уровня специфических IgE-антител (sIgE) в крови пациента, т.е. конечного продукта специфического ответа клеток. Наиболее широко распространенным принципом этого теста является твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA от англ. enzyme-linked immunosorbent assay) в различных модификациях. Определение может быть выполнено с некоторой задержкой после взятия крови у пациента. Из одной порции крови могут быть определены антитела против многих аллергенов. Однако эти результаты могут иногда отличаться от кожных тестов. Например, антитела к аллергену могут исчезать, когда пациент не контактирует с этим аллергеном в течение некоторого времени, даже если речь идет о реакции гиперчувствительности. Часто обнаруживают также перекрестно-реагирующие антитела, и способ в принципе может быть плохо стандартизован.

Поэтому в последнее время стали разрабатываться способы, которые контролируют непосредственный ответ клеток на стимуляцию. Особое внимание было уделено базофилам. Они представляют собой специализированные эффекторные клетки иммунной системы, играющие важную роль в аллергической реакции. Сенсибилизированные клетки активируются специфическим аллергеном. Об активации можно судить, с одной стороны, по экспрессии некоторых рецепторов на поверхности этих клеток (CD63), а с другой стороны, по продукции цитокинов, которые поддерживают продукцию sIgE, и медиаторов, таких как гистамин, лейкотриены и т.д. Они ответственны за некоторые клинические проявления аллергии.

Эти способы все еще далеки от широкого применения. В настоящее время гистамин и сульфидолейкотриены могут быть определены в супернатанте после стимуляции клеток аллергеном с помощью ELISA-тестов. Недостаток заключается в необходимости разделения клеток. В процессе разделения может иметь место неспецифическая активация. Кроме того, пациент не должен принимать никаких противогистаминных средств в течение по крайней мере 48 часов.

Определение экспрессии антигена активации CD63 на базофилах имеет следующие преимущества: 1) работа с цельной кровью, 2) применение тех же растворимых аллергенов, что и для кожных тестов, 3) возможность определить 1-й тип реакций гиперчувствительности к аллергену, даже если в периферической крови не присутствуют sIgE. Кроме того, клетки не активируются перекрестно-реагирующими антителами к аллергену из-за их низкой аффинности. Но определение базофилов путем окрашивания анти-IgE-антителами имеет некоторые ограничения.

При очень низком уровне общих IgE (<80 МЕ/мл) базофилы могут быть окрашены с большим трудом (слабая флуоресценция), а при высоком уровне IgE добавленные антитела (анти-IgE) могут связываться сывороточными IgE.

Введение проточной цитометрии, т.е. способа, который позволяет метить клетки при помощи поверхностных рецепторов, сделает возможным развитие способов, которые основаны на мониторинге клеточного ответа. Таким образом, этот способ сделает возможным определение непосредственного ответа базофилов на аллерген in vitro. В периферической крови содержится очень низкий процент базофилов (около 1%). Они принадлежат к группе гранулоцитов, с которыми они разделяют большинство поверхностных антигенов. В настоящее время известно, что они в отличие от других клеток несут на своей поверхности FcεRI-рецепторы и связывают IgE. Этот факт используется для их окрашивания анти-IgE-антителами. Поэтому базофилы метят флуоресцентными антителами против IgE (ср. Basotest, производимый фирмой Orpegen Pharma).

Сущность изобретения

Авторы изобретения считают, что определение активации базофилов представляет собой способ, который наиболее приближен к условиям in vivo, при этом авторы попытались преодолеть недостатки окрашивания базофилов с помощью анти-IgE-антител. Авторы обнаружили, что более предпочтительно метить базофилы антителом, направленным против поверхностного рецептора, специфичного для них. Таким образом, недостатки, связанные в основном с низким уровнем IgE, могут быть преодолены, поскольку это мечение не зависит от указанного выше уровня. В настоящее время известно, что на базофилах экспрессируется рецептор для интерлейкина-3 (IL-3), который обозначается как CD123. Поэтому для окрашивания базофилов можно выбрать флуоресцентно меченое антитело, которое было получено против этого рецептора. Другим поверхностным маркером для окрашивания базофилов может быть CD203c, так что можно использовать анти-СD203с-антитело.

Определение осуществляют в цельной крови. В том случае, если клетки чувствительны к аллергену, то после его добавления и в течение последующей инкубации аллерген свяжется с IgE-антителами, которые специфичны к данному аллергену. Связь антиген-антитело станет для клеток сигналом к началу активации и последующему запуску процессов, которые завершатся дегрануляцией базофилов и высвобождением медиаторов, ответственных за аллергическую реакцию in vivo. Ответ базофилов контролируют путем определения экспрессии СD63-антигена. Базофилы окрашивают антителами против рецептора, который они несут на своей поверхности, предпочтительно антителом против CD123 (рецептора для IL-3) или против CD203c-рецептора. Если в организме нет антител против добавленного аллергена, связанных с базофилами пациента, то реакция антиген-антитело не возникнет, и таким образом не будет иметь место активация клеток, а следовательно, и экспрессия CD63.

Краткое описание Фигур

Приложенные Фигуры демонстрируют серии гистограмм, полученных при помощи проточного цитометра Coulter Epics XL для каждого тестируемого пациента.

Значения отдельных гистограмм:

Гистограмма 1 - Распределение клеток в соответствии с прямым (FS от англ. forward scattering) и боковым (SS от англ. side scattering) светорассеянием. Окно (Гейт) N очерчивает область, где находятся базофилы.

Гистограмма 2 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител (окно F).

Гистограмма 3 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-СD123 (или анти-CD203с/РЕ)-антител (окно А).

Гистограмма 4 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. связывания с анти-IgE/FITC.

Гистограмма 5 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. связывания с анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ).

Гистограмма 6 - Процентное распределение базофилов, которые окрашены анти-IgE/FITC (окно F, Гистограмма 2).

Квадрант 1 (В1) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - другие клетки, не базофилы, присутствующие в окне F.

Квадрант 2 (В2) - Клетки, меченые как анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами.

Квадрант 3 (В3) - Неокрашенные клетки.

Квадрант 4 (В4) - Клетки, окрашенные анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами.

Гистограмма 7 - Процентное распределение базофилов, которые окрашены анти-CD123/PE (окно А, Гистограмма 3).

Квадрант 1 (G1) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - другие клетки, не базофилы, присутствующие в окне F.

Квадрант 2 (G2) - Клетки, окрашенные как анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами.

Квадрант 3 (G3) - Неокрашенные клетки.

Квадрант 4 (G4) - Клетки, меченые анти-СD23/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами.

Гистограмма 8 - Распределение базофилов, которые мечены анти-CD123/PE (или анти-СD203с/РЕ), на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител.

Фигуры 1-1 - 1-8 иллюстрируют общую экспрессию CD123⁺/IgE⁺ на базофилах, как функцию концентрации общего IgE в сыворотке, приведенную в Таблице 1.

Фигуры 2-1 - 2-5 иллюстрируют общую экспрессию CD203c⁺/IgE⁺ на базофилах, как функцию концентрации общего IgE в сыворотке, приведенную в Таблице 2.

Фигуры 3-1 - 3-4 иллюстрируют:

Фигура 3-1 - Образец без стимуляции (отрицательный контроль КО).

Фигура 3-2 - Образец, стимулированный FMLP (неспецифический контроль).

Фигура 3-3 - Образец, стимулированный аллергенами осы.

Фигура 3-4 - Образец, стимулированный аллергенами пчелы.

Значения гистограмм на Фигурах 3-1 - 3-4:

Гистограмма 1 - Распределение клеток в соответствии с прямым (FS) и боковым (SS) светорассеянием. Окно N очерчивает область, где находятся базофилы.

Гистограмма 2 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител (окно В).

Гистограмма 3 - Процентное распределение базофилов в соответствии со связыванием антител:

Квадрант 1 (С1) - Клетки, окрашенные СD63/РЕ-антителами - другие активированные клетки, не базофилы, присутствующие в окне В (Гистограмма 2).

Квадрант 2 (С2) - Клетки, окрашенные как анти-СD63/РЕ-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами, т.е. активированные клетки.

Квадрант 3 (С3) - Неокрашенные клетки.

Квадрант 4 (С4) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - неактивированные базофилы.

Гистограмма 4 - Распределение клеток в соответствии с интенсивностью их флуоресценции, т.е. со связыванием анти-IgE/FITC.

Гистограмма 5 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. по связыванию CD63/PE.

Фигуры 4-1 - 4-8 иллюстрируют сравнение результатов анти-IgE /FITC-CD63/PE и анти-CD123/PE-CD63/FITC.

Примеры

Пример 1

Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS (забуференный физиологический раствор) в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP (хемотаксического пептида N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина) в концентрации 0,433 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут, затем переносят в ледяную баню. Затем в каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-CD123-антител, меченых РЕ (от англ. phycoerythrine - фикоэритрин; от фирмы Becton Dickinson), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Пример 2

Тест выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля - 100 мкл FMLP в концентрации 0,433 мкг/мл. В тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут, затем переносят в ледяную баню. Затем в каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител, меченых РЕ (от фирмы Immunotech), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Пример 3

Тест выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,5 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля - 100 мкл FMLP в концентрации 0,433 мкг/мл. В тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител, меченых РЕ (от фирмы Immunotech), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Пример 4

Анализ осуществляют с помощью набора, который содержит 1 мл раствора IL-3 (Sigma) в концентрации 0,05 мкг/мл, 200 мл PBS, 2 мл анти-СD63 -антител, меченых FITC (Beckman-Coulter), 2 мл анти-СD203с-антител, меченых РЕ (Beckman-Coulter), 10 мл раствора FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл и 200 мл лизирующего раствора NH₄Cl. Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител и 20 мкл моноклональных анти-СD63-антител. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Пример 5

Анализ осуществляют с помощью набора, который содержит 1 мл раствора IL-3 (Sigma) в концентрации 1 мкг/мл, 200 мл PBS, 2 мл анти-СD63-антител, меченых FITC (Beckman-Coulter), 2 мл анти-СD203с-антител, меченых РЕ (Beckman-Coulter), 10 мл раствора FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл и 200 мл лизирующего раствора NH₄Cl. Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител и 20 мкл моноклональных анти-СD63-антител. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH₄Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.

Результаты измерений на проточном цитометре Coulter Epics XL (Beckman-Coulter) приведены в следующих Таблицах и проиллюстрированы на приложенных Фигурах.

Ключ к сокращениям и терминологии:

IL-3 - интерлейкин-3

PBS - забуференный физиологический раствор

FMLP - N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланин

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

РЕ - фикоэритрин

DF - Dermathophagoides farinae (акарид)

DP - Dermathophagoides pteronyssinus (акарид)

окно (gate), установка (селекция) окна (gating) - в области цитометрии: определение области, где будут анализироваться клетки, например клетки, окрашенные моноклональными антителами.

Таблица 1:
Общая экспрессия CD123⁺/IgE⁺ на базофилах, как функция общей концентрации IgE в сыворотке№ пациентаIgECD123⁺IgE⁺ Ед/млокно IgE⁺окно CD 123⁺МН4879%56%1845541,921%19%15931>1780032%80%1766916992%91%1839442838,6%84,5%184835385%100%1853925172%87%1853512,512%2,5%1850711,16,2%3%18517>200062,7%65,3%1876566,581,4%73%125292293%71%1258039588%80%1256010,3небольшое кол-во клеток4,8%125309568%69%198649182,7%84.1%JK20091%85%

Таблица и Фигуры 1-1 - 1-8 дают несколько примеров двухцветного окрашивания базофилов. Определили процентное содержание базофилов, окрашенных анти-IgE-антителами, которые несут также CD123-рецептор, и наоборот, процентное содержание базофилов, окрашенных анти-CD123, которые являются также анти-IgE-положительными.

Из таблицы следует, что окрашивание базофилов анти-IgE-антителами соответствует сывороточным уровням IgE 100-400 Ед/мл. При низком уровне IgE (пациенты МН, 18535,18455,18507,12560) базофилы, окрашенные анти-IgE, не могут быть определены, поскольку антитела не связываются с ними. С другой стороны, при высоком уровне IgE (пациент 15931) наблюдается либо неспецифическое связывание антител с моноцитами, либо замещение добавленных антител сывороточным IgE.

Таблица 2:
Общая экспрессия CD203c⁺/IgE⁺ на базофилах, как функция общей концентрации IgE в сыворотке№ пациентаIgECD203c⁺IgE⁺ Ед/млокно IgE⁺окно CD123c⁺198949177,4%82,3%1939742,977,9%67,7%2015642,592,7%90,7%МН4891,5%45,4%JK20087,1%97,3%

Таблица и приложенные Фигуры 2-1 - 2-5 дают несколько примеров двухцветного окрашивания базофилов. Определили процентное содержание базофилов, окрашенных анти-IgE-антителами, которые несут также СD203с-рецептор, и наоборот, процентное содержание базофилов, окрашенных анти-СD203с, которые являются также анти-IgE-положительными.

Активация базофилов, как функция концентрации IL-3

Таблица 3Концентрация IL-3, нг/млОтрицательный контроль, КОНеспецифический контроль, KNСпец. стимуляция, смесь из 3 видов трав51,6%37,5%38,4%2,55,9%34,1%28,7%1,251,6%27,8%29,2%0,0621,6%30,6%28,2%0 (PBS)1,0%15,2%3,9%Таблица 4Концентрация IL-3, нг/млОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, эпителий собаки53,3%56,9%2,56,3%53,4%1,25-51,6%0,625-49,4%0,3123,1%49,2%0,156-51,8%0,0782,8%44,3%0,039-42,5%0 (PBS)6,4%40,7%Таблица 5Концентрация IL-3, нг/млОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, DF (акарид)Неспец, стимуляция, KN51,6%82,1%18,5%2,52,5%83,3%16,4%1,252,5%83,2%15,0%0,6253,1%85,5%16,2%0,3123,7%81,1%17,1%0,1563,9%81,1%14,5%0 (PBS)2,6%17,0%10,9%Таблица 6Конц. IL-3 в образце, нг/млОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, DF (акарид)41,32,8%81,9%20,64,3%85,7%10,3-87.7%5,16-82,8%2,585,1%78,5%1,29-67,2%0,653,8%51,3%0 (PBS)6,3%6,2%Таблица 7Конц. IL-3 в образце, нг/млОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, смесь из 3 видов трав41,33,4%86,6%20,65,3%86,7%10,3-86,0%5,16-80,9%2,585,1%78,6%1,29-66,1%0,654,5%62,0%0 (PBS)4,3%39,0%

Активация базофилов, как функция времени инкубации с аллергеном

Таблица 8Время инкубации в минутахОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, DF (акарид)Неспец. стимуляция, KN155,8%85,0%24,3%303,1%86,4%19,0%452,5%77,9%19,5%Таблица 9Время инкубации в минутахОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, смесь видов трав -STНеспец, стимуляция, KN154,3%32,4%40,9%306,7%31,5%41,6%4511,4%35,1%15,0%Таблица 10Время инкубации в минутахОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, осаСпец. стимуляция, пчелаНеспец. стимуляция, KN156,6%88,1%8,4%23,4%304,7%89,1%11,9%37,3%456,7%78,5%10,5%28,5%Таблица 11Время инкубации в минутахОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, DF (акарид)Спец. стимуляция, яичный белокНеспец. стимуляция, KN152,4%7,6%6,8%41,6%302,9%4,5%7,4%42,1%454,8%13,0%4,6%22,4%

Активация базофилов, как функция преинкубации крови с IL-3

Таблица 12Время инкубации в минутахОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, смесь видов трав - STНеспец. стимуляция, KN05,3%99,1%28,0%105,8%96,8%53,0%Таблица 13Время преинкубации в минутахОтрицат. контроль, КОСпец. стимуляция, березаСпец. стимуляция, сельдерейСпец. стимуляция, кивиСпец. стимуляция, смесь видов травНеспец. стимуляция, KN02,7%94%94,7%11,9%98,4%48%104,1%94%94%12,5%99%74,5%Таблица 14Время инкубации в минутахОтрицательный контроль, КОСпец. стимуляция, смесь видов трав - STНеспец, стимуляция, KN05,3%99,1%28,0%105,8%96,8%53,0%

Активация базофилов, как функция разведения аллергена

Таблица 15АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв. 5хРазв. 10хРазв. 20хСельдерей50,6%80,3%91%Береза46,5%46,2%46,3%Цветки пшеницы7,7%13,5%8,6%Таблица 16АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв. 10хРазв. 20хРазв. 40хРазв. 80хРазв. 100хОса30,9%13,2%10,4%--Пчела29,7%40,8%50,0%41,5%36,8%

Таблица 17АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв.10хРазв. 100хРазв. 1000хЯблоко52,8%7,5%1,0%Грецкий орех12,6%57,2%5,6%Таблица 18АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв. 10хРазв. 100хРазв. 1000хРайграс31%25%21%Тимофеевка32%32,5%25%Таблица 19АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв. 10хРазв. 100хРазв. 1000хСмесь из 3 видов трав42%43,5%54,3%Таблица 20АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв. 10хРазв. 100хРазв. 1000хСмесь из 3 видов трав39%10.7%6,7%Таблица 21АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв. 10хРазв. 100хРазв. 1000хОса54,8%58%11,2%Пчела56,6%51,8%58,8%Таблица 22АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв. 10хРазв. 100хРазв. 1000хОса59,8%67%15,4%Пчела54,6%56,3%22,8Таблица 23АллергенКонцентрация аллергена 100 Ед/млРазв. 10хРазв. 100хОса24,8%16,8%Пчела6.2%11%

Активация, как функция концентрации IL-3 и разведения аллергена

Таблица 24Концентрация IL-3, нг/мл.Отрицат. контроль, КОСпец. стим., пчела 10хСпец. стим., пчела 100хНеспец, стим., KN2,56,9%85,2%94,7%41,1%1,253,4%77,1%75,2%39,40,6252,2%86,9%80,2%42,4%

Базовая концентрация аллергена составляет 100 Ед/мл

Нормальные значения:КО <8%  с аллергеном <15%

Сравнение результатов пациента, полученных описанным способом (базофилы, окрашенные анти-IgE, анти-CD123 или анти-203-антителами), с тестом, названным BASOTEST, доступным от фирмы ORPEGEN

Сравнение: анти-IgE/CD63 против Basotest

Образец 1

 Отрицат. контроль, КОСпец. стим., березаСпец. стим., сельдерейСпец. стим., смесь травIgE/CD636,0%93%95,8%12,9%Basotest5,5%87,8%90%13,5%

Образец 2

 Отрицат. контроль, КОСпец. стим., пчелаСпец. стим., осаСпец.стим., березаСпец. стим., смесь травIgE/CD631,6%0,9%63,6%2,0%1,0%Basotest3,6%1,0%68,1%1,6%1,3%

Сравнение: анти-СВ123 против Basotest

Образец 3

 Отрицат. контроль, КОСпец. стим., DF (акарид)Спец. стим., DP (акарид)Спец. стим., смесь травCD123/CD636,4%11,8%11,7%12,3%Basotest2,4%2,9%4,2%11,7%

Образец 4

 Отрицат. контроль, КОСпец. стим., осаСпец. стим., пчелаНеспец, стим., KNCD123/CD632,3%8,5%5,2%46,1%Basotest1,0%5,2%1,5%42,3%

Сравнение: Basotest против анти-CD123/CD63, анти-СD203с/СD63

Образец 5.

 Отрицательный контроль, КОНеспец. контроль, KNСпец. стим., эпителий собакиBasotest3,5%78,8%5,1%CD123/CD635,8%68,6%10,7%CD203/CD634,2%84,8%6.7%

Сравнение: анти-IgE/CD63 против Basotest, анти-CD123/CD63, анти-CD203c/CD63

Образец 6

 CD 123 или CD203/IgEОтрицательный контроль, КОНеспец. контроль, KNСпец. стим., DF (акарид)IgE/CD63-3,1%19,0%86,4%Basotest-5,4%19,0%85,9%CD123/CD6385%2,4%32,0%85,3%CD203/CD6396,7%5,9%36,5%92,3%

Сравнение: анти-IgE/FITC-CD63/PE, анти-CD123/PE-CD63/FITC и CD203c/PE-CD63/FITC.

Анализировали гиперчувствительность к аллергенам пчелы и осы. Результаты проиллюстрированы на Фигурах 3-1 - 3-4 и выражены в виде процентного содержания положительных базофилов, т.е. базофилов, которые чувствительны к аллергену (на Фигурах Гистограмма 3 или 6, квадрант 2 - клетки, которые несут как маркер базофилов, так и антиген активации CD63). КО - образец без стимуляции (отрицательный контроль).

Клеточное мечениеКО, %оса, %пчела, %IgE/CD635,15,061,8CD123/CD631,53,456,6CD203c/CD633,56,250,3

Нормальные значения:КО <8%  с аллергеном <15%

Для сравнения для пациента были определены специфические IgE-антитела против следующих аллергенов:

оса0,35 Ед/млпчела1,4 Ед/мл положительными являются значения >0,35 Ед/мл

Благодаря уровню общего IgE (около 90 МЕ/мл) все три способа окрашивания базофилов согласуются со сравниваемыми результатами.

Окрашивание клеток антителами против IgE (анти-IgE/FITC) и против антигена активации CD63 (CD63/PE). Сравнение результатов: анти-IgE/FITC-CD63/PE против анти-CD123/PE-CD63/FITC

Была проанализирована гиперчувствительность к аллергенам яичного белка, коровьего молока и цветков пшеницы.

Результаты проиллюстрированы на Фигурах 4-1 - 4-8 и выражены в виде процентного содержания положительных базофилов, т.е. базофилов, которые чувствительны к аллергену (на Фигурах Гистограмма 3 или 6, квадрант 2 - клетки, которые несут как маркер базофилов, так и антиген активации CD63), КО - образец без стимуляции (отрицательный контроль).

Мечение базофиловКО, %яичный белок, %коровье молоко, %цветки пшеницы, %IgE/CD636,057,262,65,8CD123/CD636,05770,711,1

Нормальные значения:КО <8%  с аллергеном <15%

Для сравнения для пациента были определены специфические IgE-антитела против следующих аллергенов:

яичный белок>25 Ед/млкоровье молоко>25 Ед/млцветки пшеницы1,71 Ед/мл; положительными являются значения >35 Ед/мл

Из-за высокого уровня общего IgE (>17800 МЕ/мл) более подходящим является окрашивание базофилов анти-CD123-антителами, чем анти-IgE-антителами (по-видимому, имеет место их связывание с сывороточным IgE).

Расхождение между результатами спец. IgE против цветков пшеницы (1,7-положительные) и негиперчувствительностью, обнаруженной авторами изобретения, подтверждает их находку, что в процессе определения sIgE имеет место неспецифическое связывание. Одновременно определяют перекрестно-реагирующие антитела (ложно-положительные результаты), которые являются антителами с низкой аффинностью и которые не часто вызывают клинические реакции.

Сравнение результатов активации базофилов, sIgE и клинических проявлений

Аллерген: пчела

Пациент% активированных базофиловСпецифические IgE против аллергенов пчелыКлинические проявленияСе-I51,8%14,6SSRCe-D56,3%1,4SSRВо20%<0,35SLRНо5,2%<0,35?En6,2%<0,35?Ben82%1,33SSRHav5,7%<0,35?Sev5,6%<0,35?Sch77%>17,5?Fru68,5%>17,5?Bo40,8%>17,5?Vla1,8%0,35?Vl1,7%0,35?Ja5,9%0,35?Kr2,5%0,75?Pru78,9%0,52?Tu2,0%0,65?He8,2%0,35?Ha11,9%0,35?Ba57,4%1,4SSRSko10,3%0,36?

SSR - тяжелая системная реакция, SLR - тяжелая местная реакция

Положительные результаты:>0,35 Ед/мл sIgE  >15% активированных базофилов

Аллерген: оса

Пациент% активированных базофиловСпецифические IgE против аллергенов осыКлинические проявленияVa88%>17,5SSRCe-I58%<0,35SSRCe-D59,95,9SSRВо30%<0,35SLRНо7%<0,35?En24,8%0,51?Ben8,5%<0,35?Hav57,8%7,33SSRSev58%<0,35SSRSch86%>17,5SSRFru74,3%1,04?Bo30,9%1,33?Vla3,2%<0,35?Vl2,1%<0,35?Ja27,6%0,59?Kr71,5%0,75SSRPru78%<0,35?Tu7,1%0.42?He76,1%<0,35SSRHa89%0,87SSRBa8,1%<0,35?Sko49,7%<0.35SSL

SSR - тяжелая системная реакция, SLR - тяжелая местная реакция

Положительные результаты:>0,35 Ед/мл sIgE  >15% активированных базофилов

Изобретение относится к области аллергологии. Сущность: изложен способ определения активации базофилов после стимуляции аллергеном для определения гиперчувствительности к некоторым веществам, при котором образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 50 нг/мл, в зависимости от объема образца, и соответственно разведенный аллерген в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 минут, после чего добавляют окрашивание анти-СD63-антителом в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и антителом против поверхностного рецептора базофилов в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, и образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 минут, а затем лизируют и подвергают проточной цитометрии. Второй объект: набор для такого определения. Технический результат - повышение эффективности аллергодиагностики. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 24 табл., 4 ил.

1. Способ измерения активации базофилов для определения гиперчувствительности к аллергенам, характеризующийся тем, что образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 50 нг/мл в зависимости от объема образца и соответственно разведенный аллерген в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 мин, после чего добавляют меченое анти-СD63-антитело в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и меченое антитело против поверхностного маркера базофилов, выбранное из анти-СD123 или анти-СD203с антител, в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, затем образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 мин, лизируют и подвергают проточной цитометрии.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 5 нг/мл в зависимости от объема образца и соответственно разведенного аллергена в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 мин, после чего добавляют меченое анти-СD63-антитело в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и меченое антитело, выбранное из анти-CD123 или анти-СD203с антител, в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, затем образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 мин, лизируют и подвергают проточной цитометрии.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.5. Набор для определения гиперчувствительности к аллергенам, основанного на измерении активации базофилов, с помощью способа по любому из пп.1-4, характеризующийся тем, что он содержит, из расчета на 100 анализов, от 1 нг до 2 мкг интерлейкина-3, 200 мл буфера, 0,3-3 мл меченого анти-СD63-антитела и 0,3-3 мл меченого антитела против поверхностного маркера базофилов, выбранного из анти-СD123 или анти-СD203с антител, 4,33 мкг N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина и при необходимости традиционные растворители.6. Набор по п.5, отличающийся тем, что он содержит, из расчета на 100 анализов, от 1 до 100 нг интерлейкина-3,200 мл буфера, 0,3-3 мл меченого анти-СD63-антитела и 0,3-3 мл меченого антитела, выбранного из анти-СD123 или анти-СD203с антител, 4,33 мкг N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина и при необходимости традиционные растворители.