СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПОСТВАКЦИННОГО И ИНФЕКЦИОННОГО БРУЦЕЛЛЁЗНОГО ПРОЦЕССОВ ПО СТЕПЕНИ ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА К БРУЦЕЛЛАМ В УСЛОВИЯХ IN VITRO Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к дифференциальной диагностике аллергической реакции организма, обусловленной вакцинацией против бруцеллеза и инфекционным бруцеллезным процессом.

Согласно Санитарно-эпидемиологическим правилам СП 3.1.7.2613-10 «Профилактика Бруцеллеза», профилактические прививки против бруцеллеза входят в Национальный календарь прививок по эпидемическим показаниям. Вакцинация проводится в очагах козье-овечьего типа лицам, достигшим 18 лет, выполняющим работы по заготовке, хранению, обработке сырья и продуктов животноводства, по убою скота, заготовке и переработке полученных от него мяса и мясопродуктов, животноводам, ветеринарным работникам, зоотехникам, а также работникам бактериологических лабораторий, работающим с живыми культурами.

Для иммунизации людей против бруцеллеза применяется сухая живая вакцина, приготовленная из вакцинного штамма В. abortus 19 ВА, которая способствует сохранению наивысшего напряженного иммунитета в течение 5-6 месяцев. Ревакцинация проводится через 12 мес после вакцинации лицам с отрицательными серологическими и аллергическими реакциями на бруцеллез.

При выявлении случаев заболевания бруцеллезом сельскохозяйственных животных в животноводческих хозяйствах вне зависимости от форм собственности организуется проведение внеочередного профилактического медицинского осмотра работников, включая лабораторное обследование (серологическое, аллергическое).

При отрицательных результатах серологического и бактериологического исследования, диагностика бруцеллеза основывается на клинических данных и результате пробы Бюрне (Вершилова П.А., 1974, E1-Mohammady Н. et al., 2012, Naves J.H. et al., 2012). В этих случаях необходимо особенно тщательно дифференцировать иммуноаллергическую перестройку организма в результате заболевания бруцеллезом или вследствие ранее проведенной вакцинации против бруцеллеза.

В связи с тем, что лабораторная диагностика бруцеллеза, в настоящее время, не позволяет дифференцировать поствакцинальный и инфекционный процессы (МУК 4.2.3010-12. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней), возникают трудности с выявлением заболевших людей среди лиц, иммунизированных против бруцеллеза.

Научно и практически доказана высокая диагностическая ценность кожной пробы Бюрне при исследовании иммуноаллергической перестройки у больных бруцеллезом и вакцинированных лиц (Онищенко Г.Г., 2006, Denoel Р.А. et al., 1997, Bercovich Z., 2000, Hort G.M., 2003).

Реакция на внутрикожное введение аллергена бруцеллезного жидкого - Бруцеллин, у людей больных бруцеллезом и иммунизированных вакциной из штамма В. abortus 19 ВА сопровождается гиперемией, отеком, болезненностью на месте введения препарата. Реакция становится положительной через 3-5 недель от начала болезни или вакцинации и сохраняется в течение длительного времени иногда до нескольких лет (Вершилова П.А. с соавт. 1974).

При помощи пробы Бюрне невозможно проведение дифференциальной диагностики аллергической перестройки организма обусловленной хроническим бруцеллезом и поствакцинальными иммунологическими процессами (Вершилова П.А. с соавт. 1974, Курманова К.Б. 1999, Желудков М.М. 2009, Dizbay М. et al., 2007, Shoja М.М. et al., 2008, Catakli Т. et al., 2009).

В связи с тем, что применяемая для иммунизации людей сухая живая вакцина, обеспечивает напряженность иммунитета в течение 5-6 месяцев, а ревакцинация контингента проводится через 12 мес, возникает риск инфицирования людей в течение 6-7 мес до ревакцинации. Заболевшие могут положительно реагировать на внутрикожное введение Бруцеллина, даже при серонегативных реакция на бруцеллез.

Наиболее близким к предлагаемому способу можно считать тест активации базофилов in vitro, при помощи которого определяют аллергическую перестройку организма при пищевых и лекарственных аллергиях (Клыкова Т.В. с соавт., 2010, Богачева Н.В. с соавт., 2011, Boumiza R, Debard A.-L., Monneret G., 2006. Maria L. Sanz et al., 2010).

Применительно к бактериальным инфекциям аналогичные исследования не проводились.

Предлагаемый способ основан на оценке аллергической реакции организма и может использоваться как дифференциальный тест инфекционного и поствакцинального бруцеллезного процесса у больных и иммунизированных против бруцеллеза людей.

Целью настоящего изобретения является дифференциация инфекционного и вакцинного бруцеллезного процессов по уровню в крови людей активированных Бруцеллином базофилов, экспрессирующих рецепторы CD63 определяемых методом проточной цитофлюорометрии.

Поставленная цель достигается тем, что в стабилизированную кровь обследуемых людей добавляют Бруцеллин, после чего определяют экспрессию на базофилах рецепторов к маркеру дегрануляции CD63 методом проточной цитометрии.

Заявляемый способ отличается возможностью дифференцировать инфекционный и вакцинный бруцеллезный процесс по уровню количественных различий активированных бруцеллезным антигеном базофилов крови. Экспрессию на базофилах маркера дегрануляции CD63 определяют на проточном цитометре FACSCalibur, используя диагностический набор «Flow CAST», содержащий буфер для стимуляции, лизирующиий раствор, специфические моноклональные антитела, положительный контроль (Buhlmann laboratories, Швейцария).

На каждого испытуемого используют три отдельные пробирки типа «ФАЛКОН» объемом 15×75 мм.

1-я пробирка - фоновая проба содержит 50 мкл «буфера для стимуляции»;

2-я пробирка - содержит 50 мкл «положительного контроля»;

3-я пробирка - содержит 50 мкл аллергена бруцеллезного жидкого - Бруцеллин.

Во все три пробирки вносят по 100 мкл «буфера для стимуляции» и 50 мкл стабилизированной крови взятой от испытуемых людей, перемешивают и во все пробирки добавляют по 20 мкл суспензии моноклональных антител против маркера дегрануляции базофилов CD63. Полученную смесь инкубируют 15 мин на водяной бане при 37°C. Затем добавляют 2,0 мл предварительно прогретого до 18-28°C рабочего разведения лизирующего раствора. Пробы оставляют на 5-10 мин при 18-28°C, после чего центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин, удаляют супернатант и вносят 450 мкл отмывочного буфера.

Экспрессию на базофилах рецепторов активации базофилов CD63 определяют на проточном цитометре.

При учете результатов аллерготестирования из процента активированных базофилов, экспрессирующих рецепторы CD63 в пробирке с антигеном вычитают процент базофилов в фоновой пробе, полученная разница и является искомым результатом.

Пример: Исследовали кровь 16 пациентов с установленным диагнозом - хронический бруцеллез и 15 человек, иммунизированных штаммом В. abortus 19 ВА. Контролем служила кровь 12 доноров не больных бруцеллезом и не вакцинированных против данной инфекции.

В результате эксперимента установлено увеличение количества базофилов экспрессирующих рецепторы CD63⁺ в крови людей больных бруцеллезом, по сравнению с данными, полученными у вакцинированных добровольцев. У вакцинированных против бруцеллеза людей количество активированных Бруцеллином базофилов находится в пределах от 5,1% до 19%, у больных бруцеллезом от 19,1% и выше, у относительно здоровых доноров от 0% до 5%.

Достоинством заявляемого способа является возможность дифференцировать вакцинный и постинфекционный бруцеллезный процессы. Использование указанного способа исключает добавочное антигенное воздействие на организм и позволяет проводить постановку и учет реакций в течение 1 часа.

Таким образом, предлагаемый способ реально осуществим, может использоваться как дифференциальный тест инфекционного и вакцинного бруцеллезного процесса у больных бруцеллезом и вакцинированных против бруцеллеза людей.

Изобретение относится к области медицины и касается способа дифференциальной диагностики поствакцинального и инфекционного бруцеллезного процессов у людей в условиях in vitro. Охарактеризованный способ включает инкубацию цельной гепаринизированной крови с бруцеллезным жидким аллергеном - Бруцеллином и моноклональными антителами против маркера дегрануляции базофилов - CD63⁺. Далее определяют методом проточной цитометрии количество активированных базофилов, которое у вакцинированных против бруцеллеза находится в пределах от 5,1% до 19%, у больных бруцеллезом людей от 19,1% и выше. Изобретение может быть использовано в дифференциальной диагностике поствакцинального и инфекционного процессов при бруцеллезе.

Способ дифференциальной диагностики поствакцинального и инфекционного бруцеллезного процессов у людей в условиях in vitro, характеризующийся инкубацией цельной гепаринизированной крови с бруцеллезным жидким аллергеном - Бруцеллином и моноклональными антителами против маркера дегрануляции базофилов - CD63⁺, заключающийся в определении методом проточной цитометрии количества активированных базофилов, которое у вакцинированных против бруцеллеза находится в пределах от 5,1% до 19%, у больных бруцеллезом людей от 19,1% и выше.