ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ STAPHYLOCOCCUS WARNERI - ПРОДУЦЕНТА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДНОГО ФАКТОРА Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C07K2/00 C07K14/31 A61P31/04 C12R1/44 

Описание патента на изобретение RU2274654C2

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии и предназначено для выращивания стафилококков с целью получения антибактериальных пептидных соединений.

Известна богатая питательная среда LB, предназначенная для выращивания широкого спектра микроорганизмов, в том числе бактерий рода Staphylococcus, содержащая следующие компоненты, г на 1 л дистиллированной воды: триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, натрий хлористый - 10 г (Дж.Миллер Эксперименты в молекулярной генетике. Под ред. С.И.Алиханяна. М.: Мир, 1976, с.394-395).

При росте культуры-продуцента S.warneri на данной среде при достижении количества клеток 1,9-2·109 КОЕ/мл накопление антибактериального пептидного фактора в среде прекращается. В результате данная среда, обеспечивая рост бактерий-продуцентов, не позволяет получить высоких количеств антибактериального пептидного фактора в культуральной жидкости (В.П.Коробов, Л.М.Лемкина, Т.В.Полюдова. Продукция антибактериального фактора широкого спектра действия клетками Staphylococcus warneri. Доклады Академии наук, 2003, том 390, №5, с.1-3).

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому изобретению является среда Muller-Hinton (MH), часто используемая для культивирования микроорганизмов, в том числе стафилококков, а также для постановки тестов на определение чувствительности бактерий к антибактериальным агентам, содержащая, г на 1 л дистиллированной воды: казаминовые кислоты - 17,5 г, экстракт мяса - 3 г, крахмал - 1,5 г, рН 7,0-7,2 (Atlas R.M., Parks L.C. Handbook of Microbiological media, 1993, p.629).

Использование среды МН для выращивания стафилококков для получения повышенного содержания антибактериального пептидного фактора в среде культивирования дало положительный результат. Через 10 часов роста достигается высокий выход биомассы клеток -4,5·109 КОЕ/мл. Антибактериальная активность супернатанта культуры-продуцента к этому часу проявлялась в разведении 1/1024. Однако пересев стафилококков со среды LB на жидкую среду МН вызывал удлинение lag-фазы и более поздний переход в стационарную стадию роста, когда наблюдалась максимальная продукция антибактериального пептидного фактора. Другим недостатком данной среды является необходимость щадящего режима стерилизации (при 115°С в течение 10 мин), не обеспечивающего абсолютной стерильности растворов.

Техническим результатом изобретения является повышение ростовых свойств среды и увеличение продукции культурой S. warneri антибактериального пептидного фактора. Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда содержит следующие компоненты, г на 1 л дистиллированной воды: казаминовые кислоты - 10-12, дрожжевой экстракт - 3-5, калий фосфорнокислый двузамещенный - 7-8, магний сернокислый - 0,1-0,2, натрий лимоннокислый 2-водный - 0,5-0,6, аммоний сернокислый - 2-2,5, глюкоза - 1-2, рН среды 7,0-7,2.

Для предотвращения осахаривания крахмала, наблюдающегося в процессе автоклавирования среды МН при 115°С, крахмал заменен стерильным раствором глюкозы.

Замена экстракта мяса в среде-прототипе на дрожжевой экстракт позволила значительно удешевить среду, но это привело к снижению показателей роста.

Для восстановления ростовых свойств полученной среды в ее состав был введены минеральные компоненты, что привело к восстановлению оптимальных параметров роста S.warneri и резкому увеличению продукции антибактериального пептидного фактора.

Все внесенные в состав среды изменения приводят к улучшению роста культуры S.warneri и увеличению антибактериальной активности супернатанта среды культивирования.

Среду готовят следующим образом:

Пример 1.

Для приготовления 1 л среды берут, г:

казаминовые кислоты8дрожжевой экстракт2калий фосфорнокислый двузамещенный5магний сернокислый0,1натрий лимоннокислый 2-водный0,5аммоний сернокислый2глюкоза1вода дистиллированнаяОстальное

Готовят навески компонентов, растворяют их в 500-600 мл дистиллированной воды, доводя рН раствора до значения 7,0-7,2 при помощи фосфорной кислоты, а общий объем дистиллированной водой до 1 л. Среду разливают по 400 мл во флаконы емкостью 500 мл и стерилизуют при 120°С в течение 1 ч. Перед засевом микроорганизмов добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы до конечной концентрации 0,1%.

Антибактериальную активность в супернатантах культуры-продуцента, полученных при выращивании на среде-аналоге, среде-прототипе и предлагаемой среде, проверяли на жидкой среде МН с использованием планшетов для иммунологических реакций. В лунки планшета помещали по 100 мкл питательной среды МН, затем в первую лунку ряда вносили 100 мкл исследуемого стерильного супернатанта культуры-продуцента и готовили ряд последовательных двукратных разведений, после чего в каждую ячейку добавляли по 10 мкл суспензии чувствительных. клеток S.epidermidis, содержащей 1,5-2·106 КОЕ/мл. Планшеты инкубировали в термостате в течение 16-18 ч при 37°С. За единицу активности (ЕА) антибактериального пептидного фактора принимали обратную величину максимального разведения, при котором наблюдалось торможение роста тест-бактерий.

Пример 2. Для приготовления 1 л среды, берут, г:

казаминовые кислоты13дрожжевой экстракт5калий фосфорнокислый двузамещенный10магний сернокислый0,1натрий лимоннокислый 2-водный0,5аммоний сернокислый2,5глюкоза2вода дистиллированнаяОстальное

Процедура приготовления по примеру 1. Перед засевом микроорганизмов в среду добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы до конечной концентрации 0,2%.

Пример 3 (по заявленному изобретению). Для приготовления 1 л среды берут, г:

казаминовые кислоты10дрожжевой экстракт3калий фосфорнокислый двузамещенный7магний сернокислый0,1натрий лимоннокислый 2-водный0,5аммоний сернокислый2глюкоза2вода дистиллированнаяОстальное

Процедура приготовления по примеру 2.

Рост культуры S.warneri на среде-аналоге, среде-прототипе и предлагаемой среде представлен на чертеже. Интенсивность продукции антибактериального пептидного фактора на разных средах показана в таблице 1.

Параметры роста S.warneri и уровень антибактериальной активности супернатантов на средах по примерам 1-3 приведены в таблице 2.

Как видно из чертежа и таблицы 1, скорость роста культуры S.warneri и продукция антибактериального пептидного фактора значительно интенсивнее на предлагаемой среде. Антибактериальная активность на предлагаемой среде выше в 16 раз по сравнению со средой-аналогом и в 4 раза по сравнению со средой-прототипом.

Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что использование среды по примеру 1 увеличивает время культивирования бактерий, а антибактериальная активность супернатантов снижается в 4 раза.

Как указано в таблице 2, не наблюдается отличий в интенсивности роста и продукции антибактериального пептидного фактора на средах по примерам 2 и 3. Использование предлагаемой среды с соотношением компонентов, указанным в примере 3, является оптимальным для культивирования S.warneri и получения антибактериального пептидного фактора, а также значительно сокращает расход питательных компонентов.

Таким образом, применение разработанного варианта жидкой питательной среды обеспечивает интенсивный рост стафилококков с первых часов культивирования и позволяет достигнуть максимального выхода антибактериального пептидного фактора через 8 ч роста культуры. Стоимость 1 л предлагаемой среды 2,21 у.е., что ниже стоимости среды Muller-Hinton и среды LB в 2,2 и 1,6 раза соответственно.

Таблица 1СредаСреда-аналогСреда-прототипПредлагаемая средаАнтибактериальная активность (ЕА)25610244096Таблица 2Показатели ростаПример 1Пример 2Пример 3Длительность культивирования (часы)9-107-87-8Максимальное количество бактерий (КОЕ/мл)2,8-3×1093,5×1093,5×109Антибактериальная активность (ЕА)102440964096

Похожие патенты RU2274654C2

название год авторы номер документа
ШТАММ STAPHYLOCOCCUS HOMINIS KLP-1 - ПРОДУЦЕНТ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ, ИНГИБИРУЮЩИХ РАЗВИТИЕ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ 2010
  • Коробов Владимир Павлович
  • Лемкина Лариса Марковна
  • Полюдова Татьяна Вячеславовна
RU2428470C1
ШТАММ STAPHYLOCOCCUS WARNERI IEGM KL-1 - ПРОДУЦЕНТ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕПТИДНОГО СОЕДИНЕНИЯ, ИНГИБИРУЮЩЕГО РОСТ КЛЕТОК ГРАМПОЗИТИВНЫХ БАКТЕРИЙ 2001
  • Коробов В.П.
  • Лемкина Л.М.
  • Акименко В.К.
RU2200195C2
ШТАММ ENTERОCOCCUS MUNDTII, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ СУБСТАНЦИЮ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ С АНТИЛИСТЕРИОЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2013
  • Храмов Владимир Михайлович
  • Похиленко Виктор Данилович
  • Перелыгин Владимир Владимирович
  • Садикова Гульнур Тахавиевна
  • Калмантаев Тимур Ахмерович
  • Чукина Ирина Анатольевна
  • Светоч Эдуард Арсеньевич
RU2532227C1
Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 - продуцент соединений, обладающих антибактериальной активностью 2022
  • Макарьева Татьяна Николаевна
  • Романенко Людмила Александровна
  • Минеев Константин Сергеевич
  • Шубина Лариса Кимовна
  • Гугля Елена Борисовна
  • Калиновская Наталья Ивановна
  • Иванчина Наталья Владимировна
  • Гузий Алла Григорьевна
  • Белозерова Ольга Александровна
  • Попов Роман Сергеевич
  • Михайлов Валерий Викторович
  • Щеглов Александр Сергеевич
  • Дмитренок Павел Сергеевич
  • Ямпольский Илья Викторович
  • Стоник Валентин Аронович
RU2784815C1
СПОСОБ БИОСИНТЕЗА ЦЕФАЛОСПОРИНА С С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВОГО ШТАММА ACREMONIUM CHRYSOGENUM ВКМ F-4081D 2009
  • Бартошевич Юрий Эдуардович
  • Новак Марина Иоганновна
  • Домрачева Алла Георгиевна
  • Скрябин Константин Георгиевич
RU2426793C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА SAV-RGD, СПЕЦИФИЧЕСКИ УЗНАЮЩЕГО КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ 2013
  • Вейко Владимир Петрович
  • Окорокова Наталия Анатольевна
  • Сыркина Марина Сергеевна
  • Рубцов Михаил Александрович
  • Замятнин Андрей Александрович
RU2563540C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА SAV-RGD 2014
  • Рубцов Михаил Александрович
  • Сыркина Марина Сергеевна
  • Вейко Владимир Петрович
  • Окорокова Наталья Анатольевна
  • Замятнин Андрей Александрович
RU2577138C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ПРОДУКЦИИ ЭНТЕРОТОКСИНОВ У СТАФИЛОКОККОВ 2006
  • Меньшиков Дмитрий Дмитриевич
  • Флуер Федор Семенович
  • Лазарева Елена Борисовна
  • Прохоров Владимир Яковлевич
  • Веснин Артем Валерьевич
RU2325168C2
БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА 2000
  • Кулаев И.С.
  • Степная О.А.
  • Цфасман И.М.
  • Черменская Т.С.
  • Акименко В.К.
  • Ледова Л.А.
  • Зубрицкая Л.Г.
RU2193063C2
ЖИДКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ШТАММОМ BACILLUS PUMILUS "ПАШКОВ", ОБЛАДАЮЩИХ ИНГИБИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ, ГРИБОВ И ВИРУСОВ 2010
  • Гринько Ольга Михайловна
  • Михайлова Наталья Александровна
RU2460773C2

Реферат патента 2006 года ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ STAPHYLOCOCCUS WARNERI - ПРОДУЦЕНТА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДНОГО ФАКТОРА

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии и предназначено для выращивания стафилококков с целью получения антибактериальных пептидных соединений. Питательная среда содержит компоненты в следующем соотношении, г на 1 л: казаминовые кислоты - 10-12 г, дрожжевой экстракт - 3-5 г, калий фосфористокислый двузамещенный - 7-8 г, магний сернокислый - 0,1-0,2 г, натрий лимоннокислый 2-водный - 0,5-0,6 г, аммоний сернокислый - 2-2,5 г, глюкоза - 1-2. Применение жидкой питательной среды обеспечивает интенсивный рост стафилококков с первых часов культивирования и позволяет достигнуть максимального выхода антибактериального соединения через 8 часов роста культуры. 1 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 274 654 C2

Питательная среда для выращивания Staphylococcus warneri - продуцента антибактериального пептидного фактора, содержащая казаминовые кислоты и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит дрожжевой экстракт, калий фосфорно-кислый двузамещенный, магний серно-кислый, натрий лимонно-кислый 2-водный, аммоний серно-кислый, глюкозу в следующем соотношении компонентов, г/л системы:

Казаминовые кислоты10-12Дрожжевой экстракт3-5Калий фосфорно-кислыйдвузамещенный7-8Магний серно-кислый0,1-0,2Натрий лимонно-кислый2-водный0,5-0,6Аммоний сернокислый2-2,5Глюкоза1-2Вода дистиллированнаяОстальное

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2006 года RU2274654C2

R.M.ATLAS, L.C.PARKS
Handbook of Microbiological Media
Способ изготовления фанеры-переклейки 1921
  • Писарев С.Е.
SU1993A1
ШТАММ STAPHYLOCOCCUS WARNERI IEGM KL-1 - ПРОДУЦЕНТ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕПТИДНОГО СОЕДИНЕНИЯ, ИНГИБИРУЮЩЕГО РОСТ КЛЕТОК ГРАМПОЗИТИВНЫХ БАКТЕРИЙ 2001
  • Коробов В.П.
  • Лемкина Л.М.
  • Акименко В.К.
RU2200195C2
RU 1602056 A1, 27.10.1995
ШТАММЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS LICHENIFORMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТОВ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВИРУСНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ, И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭТИХ ШТАММОВ 1997
  • Щелкунов С.Н.
  • Петренко В.А.
  • Рязанкина О.И.
  • Репин В.Е.
  • Андреева И.С.
  • Ильичев А.А.
  • Белявская В.А.
  • Сандахчиев Л.С.
  • Серпинский О.И.
  • Сиволобова Г.Ф.
  • Синяков А.Н.
  • Перминова Н.Г.
  • Тимофеев И.В.
  • Леляк А.И.
  • Ноздрин Г.А.
  • Катковский Л.П.
  • Данилюк Н.К.
  • Масычева В.И.
RU2142287C1
В.П.КОРОБОВ и др
Продукция антибактериального фактора широкого спектра действия клетками Staphylococcus warneri
Доклады Академии наук
Способ и приспособление для нагревания хлебопекарных камер 1923
  • Иссерлис И.Л.
SU2003A1
Д.МИЛЛЕР
Эксперименты в молекулярной генетике
- М.: Мир, 1976, с.394-395.

RU 2 274 654 C2

Авторы

Коробов Владимир Павлович

Лемкина Лариса Марковна

Акименко Василий Константинович

Полюдова Татьяна Вячеславовна

Даты

2006-04-20Публикация

2004-05-05Подача