ЖИДКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ШТАММОМ BACILLUS PUMILUS "ПАШКОВ", ОБЛАДАЮЩИХ ИНГИБИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ, ГРИБОВ И ВИРУСОВ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/07 

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к питательным средам для получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов и противовирусным действием в отношении энтеровирусов.

Известна синтетическая питательная среда №9, используемая в производстве споровых пробиотиков, содержащая железо (II) сернокислое 7-водное; магний сернокислый 7-водный; хлористый марганец; кальций хлористый; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5,0; глюкоза - 10,0; дрожжевой экстракт - 3,0 (ФСП 4205042435-05).

К недостаткам данной питательной среды следует отнести недостаточное влияние на выработку БАВ В.pumilus «Пашков», обладающих ингибирующими свойствами в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.

Известна синтетическая питательная среда №5, так же применяемая при производстве споровых пробиотиков, содержащая калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный; аммоний сернокислый двузамещенный; натрий лимоннокислый 5,5-водный; медь сернокислая 5-водная - 0,005; цинк сернокислый 7-водный; железо (II) сернокислое 7-водное; кальций хлористый; марганец (II) сернокислый 5-водный; магний сернокислый 7-водный; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей (ФСП 4205042435-05).

К недостаткам данной питательной среды следует отнести слабое влияние на выработку БАВ В.pumilus «Пашков», обладающих ингибирующими свойствами в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка новой жидкой питательной среды для культивирования штамма Bacillus pumilus «Пашков» с целью получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием, а также ингибирующих другие микробы.

Для решения указанной задачи разработана питательная среда для выращивания штамма Bacillus pumilus «Пашков», содержащая при рН 7,3±0,2 железо (II) сернокислое 7-водное, магний сернокислый 7-водный, хлористый марганец, кальций хлористый, калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный (K₂HPO₄·3H₂O), цитрат аммония (NH₄OOCC(OH)(CH₂COOH)₂), триптон, дрожжевой экстракт, лактозу и глицерин при следующем содержании указанных компонентов на 1 литр дистиллированной воды:

железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г

магний сернокислый 7-водный - 0,1 г

хлористый марганец - 0,01 г

кальций хлористый - 0,08 г

калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный - 0,3 г

цитрат аммония - 2,0 г

триптон - 5 г

дрожжевой экстракт - 7,0 г

лактоза - 10 г

глицерин - 40 мл.

Питательную среду готовят следующим образом.

Пример 1. Для приготовления заявленной жидкой питательной среды берут 1 литр дистиллированной воды. Последовательно вносят соли: железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г; магний сернокислый 7-водный - 0,1 г; хлористый марганец - 0,01 г; кальций хлористый - 0,08 г; калий фосфорнокислый однозамещенный 3-водный (K₂HPO₄·3H₂O) - 0,3 г; цитрат аммония (NH₄OOCC(OH)(CH₂COOH)₂) - 2,0 г/л. Каждую соль размешивают до полного растворения. Затем добавляют триптон - 5 г/л, лактозу 10 г/л, дрожжевой экстракт - 7 г/л и глицерин - 40 мл. Доводят рН среды до 7,3±0,2. После приготовления среду стерилизуют при 1 атм (121°С) 20 мин.

Готовая жидкая среда темно-желтого цвета, не содержит посторонних включений, рН среды до 7,3±0,2.

Пример 2. Влияние новой жидкой питательной среды на выработку БАВ, обладающих ингибирующими свойствами в отношении бактерий и дрожжевых грибов.

Штамм В.pumilus «Пашков» выращивали методом периодического культивирования в течение 72 часов. О наличии биологически-активных веществ (БАВ) в культуральной жидкости В.pumilus «Пашков» судили по их влиянию на кинетику роста тест-культур с помощью микробиологического анализатора с планшетным фотометром «BIOSCREEN/iEMS-reader MF» (фирма «LabMetod», Финляндия). Задержка вступления тест-штаммов или дрожжевых грибов в стадию экспоненциального роста свидетельствовала о бактериостатическом (фунгистатическом) эффекте БАВ, а отсутствие роста более 18 часов оценивалось как бактерицидный (фунгицидный) эффект (табл.1, 2, 3).

Таблица 1 Показатели ингибирующего эффекта БАВ, синтезируемых при культивировании В.pumilus «Пашков» в отношении тест-штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий Тест-штаммы Бактериостатический эффект (%) S.aureus «Никифоров» 100 S.aureus «Филиппов» 100 S.xylosus 25 100 S.flexneri 337 100 S.sonnei 170 100 E.coli O157:H55 100 P.aeruginosa 9022 100 P.mirabilis 24a 100 P.vulgaris 177 100 * - задержка роста более 18 часов (бактерицидныйэффект).

Таблица 2 Характеристика ингибирующего эффекта БАВ, синтезируемых при культивировании В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa № Название штамма БСЭ (%) № Название штамма БСЭ (%) 1 170001 100* 22 170022 100* 2 170002 100* 23 170023 100* 3 170003 100* 24 170025 (Habs1) 100* 4 170004 100* 25 170026 (Habs2) 100* 5 170005 100* 26 170027 (Habs3) 100* 6 170006 100* 27 170028 (Habs4) 100* 7 170007 100* 28 170029 (Habs5) 100* 8 170008 100* 29 170030 (Habs6) 100* 9 170009 100* 30 170031 (Habs7) 100* 10 170010 100* 31 170032 (Habs8) 100* 11 170011 100* 32 170033 (Habs9) 100* 12 170012 100* 33 170034 (Habs10) 100* 13 170013 100* 34 170035 (Habs1) 100* 14 170014 100* 35 170036 (Habs12) 100* 15 170015 100* 36 170041 (Fisher1) 100* 16 170016 100* 37 170042 (Fisher2) 100* 17 170017 100* 38 170043 (Fisher3) 100* 18 170018 100* 39 170044 (Fisher4) 100* 19 170019 100* 40 170045 (Fisher5) 100* 20 170020 100* 41 170046 (Fisher6) 100* 21 170021 100* 42 170047 (Fisher7) 100* * - задержка роста более 18 часов (бактерицидный эффект)

Таблица 3 Показатели активности БАВ, выделяемых при культивировании штамма В. pumilus «Пашков» в отношении клинических штаммов дрожжевых грибов Название штамма дрожжевых грибов Задержка роста грибов (фунгистатический эффект %) C.albicans (№1) 94,6±8,4 C.albicans (№2) 92,2±7,4 C.haemuloni 91,7±6,6 C.tropicalis 89,5±8,1 Rhodotomla spp. 88,4±9,2 Debaryomyces hansenii 92,6±8,6

Таблицы 1, 2, 3 показывают, что БАВ, выделяемые при культивировании штамма В.pumilus «Пашков» на разработанной питательной среде, обладают бактерицидным действием в отношении 9 тест-штаммов бактерий, 42 клинических штаммов Р.aeruginosa и выраженным фунгистатическим эффектом в отношении 6 клинических штаммов дрожжевых грибов.

Пример 3. Влияние новой жидкой питательной среды на выработку БАВ, обладающих ингибирующими свойствами в отношении энтеровирусов.

Противовирусную активность культуральной жидкости определяли по лечебной и профилактической схемам воздействия в отношении вирусов полиомиелита I типа, ECHO 3, ECHO 6 и Коксаки В.

Лечебная схема.

На монослой клеток, выращенных в 24-луночных планшетах, после удаления ростовой среды и однократного промывания ФСБ вносили различные дозы энтеровирусов - от 100 ТЦД_{50/0,5 мл} до 12,5 ТЦД_{50/0,5 мл} с последующей инкубацией в термостате с 5% СO₂ при 37°С в течение часа. После удаления неадсорбировавшегося вируса монослой клеток дважды промывали ФСБ и вносили различные разведения КЖ В.pumilus «Пашков» от неразведенной до 1:640 в поддерживающей среде. Учет результатов проводили через 48 и 72 часа инкубации.

Профилактическая схема.

На монослой клеток, выращенных в 24-луночных планшетах, после удаления ростовой среды и однократного промывания ФСБ вносили различные разведения КЖ В.pumilus «Пашков» от неразведенной до 1:640 в поддерживающей среде с последующей инкубацией в термостате с 5% СO₂ при 37°С в течение 24 часов. Затем КЖ удаляли, вносили различные дозы вируса от 100 ТЦД_{50/0,5 мл} до 12,5 ТЦД_{50/0,5 мл} и помещали в инкубатор на 1 ч при 37°С. Затем клетки дважды промывали ФСБ, вносили поддерживающую среду и продолжали инкубировать в течение 72 часов.

Противовирусную активность в обеих схемах оценивали по цитопатогенному действию вируса (ЦПД). Разведение КЖ, вызывающее ингибирование вирусного ЦПД на 50% по отношению к контролю, принимали за ингибирующую дозу (ИД₅₀) (табл.4, 5).

Таблица 4 Эффективность лечебного действия КЖ штамма B. pumilus «Пашков» в отношении энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов в опытах in vitro Вирусы Время наблюдения (час) Разведение препарата, обеспечивающее 100% защитный эффект Доза вируса в log ТЦД_{50/0,5 мл} 100 50 25 12,5 Polio-1 48 1:80 1:160 1:640 1:640 72 1:80 1:80 1:640 1:640 ЕСНО 3 48 1:40 1:40 1:640 1:640 72 1:40 1:40 1:160 1:320 ECHO 6 48 1:40 1:640 1:640 1:640 72 1:40 1:160 1:160 1:640 Сох В (1-6) 48 1:80 1:80 1:40 1:40 72 1:80 1:80 1:40 1:40

Из результатов, представленных в табл.4, следует, что лечебный эффект КЖ B.pumilus «Пашков» в отношении вируса полиомиелита типа I четко зависит от дозы вируса. При дозах вируса 12,5-25,0 lg ТЦД_{50/0,5 мл} 100% защита инфицированных клеток после обработки КЖ проявлялась при максимально исследованном разведении 1:640 и сохранялась в течение 72 ч. При заражении культуры клеток высокими дозами вируса 50-100 ТЦД_{50/0,5 мл} полная защита клеток наступала при обработке КЖ в разведениях 1:160-1:80 соответственно, а частичная защита сохранялась при разведениях препарата 1:320-1:160 соответственно в течение 48 часов наблюдения.

Полученные результаты свидетельствуют, что наиболее эффективное лечебное действие КЖ проявлялось в отношении вируса полиомиелита I типа и ECHO 6 и менее в отношении вируса Коксаки В (1-6).

Таблица 5 Эффективность профилактического действия КЖ в отношении энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов в опытах in vitro Вирусы Время учета (час) Разведение препарата, обеспечивающее 100% профилактический эффект Доза вируса в log ТЦД_{50/0,5 мл} 100 50 25 12,5 Polio-1 48 1:40 1:160 1:160 1:640 72 1:40 1:160 1:160 1:640 ЕСНО 3 48 0 1:160 1:640 1:640 72 0 1:160 1:640 1:640 ECHO 6 48 0 1:20 1:640 1:640 72 0 1:20 1:640 1:640 Сох В (1-6) 48 0 1:20 1:640 1:640 72 0 1:20 1:320 1:640

Результаты, представленные в табл.5, показывают профилактический эффект КЖ В.pumilus «Пашков», зависящий от дозы вируса, концентрации препарата, вида вируса и наиболее выраженный в отношении вируса полиомиелита I типа.

Пример 4. Исходные данные состава среды (г/л) рН 7,3±0,2: железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г/л; магний сернокислый 7-водный - 0,1 г/л; хлористый марганец - 0,01 г/л; кальций хлористый - 0,08 г/л; калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный (K₂HPO₄·3H₂O) - 0,3 г/л; цитрат аммония (NH₄OOCC(OH)(CH₂COOH)₂) - 2,0 г/л; триптон - 5 г/л; дрожжевой экстракт - 7,0 г/л; лактоза - 10 г/л; глицерин - 40 мл/л.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов и противовирусным действием в отношении энтеровирусов. Питательная среда содержит железо (II) сернокислое 7-водное, магний сернокислый 7-водный, хлористый марганец, кальций хлористый, калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный, цитрат аммония, триптон, дрожжевой экстракт, лактозу, глицерин и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет культивировать штамм Bacillus pumilus "Пашков" продуцент высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов и противовирусным действием в отношении энтеровирусов. 5 табл., 4 пр.

Питательная среда для выращивания штамма Bacillus pumilus «Пашков», содержащая при рН 7,3±0,2 железо (II) сернокислое 7-водное, магний сернокислый 7-водный, хлористый марганец, кальций хлористый, калий фосфорнокислый однозамещенный 3-водный, цитрат аммония, триптон, дрожжевой экстракт, лактозу и глицерин при следующем содержании указанных компонентов на 1 литр дистиллированной воды:
железо (II) сернокислое 7-водное 0,01 г магний сернокислый 7-водный 0,1 г хлористый марганец 0,01 г кальций хлористый 0,08 г К₂НРO₄·3Н₂O 0,3 г цитрат аммония 2,0 г триптон 5 г дрожжевой экстракт 7,0 г лактоза 10 г глицерин 40 мл