ШТАММ СВИНКА ВИРУСА ЛАССА, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕДИЦИНСКИХ СРЕДСТВ ЗАЩИТЫ Российский патент 2006 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Изобретение относится к области вирусологии, а именно к испытанию медицинских средств защиты (МСЗ) в отношении возбудителей особо опасных вирусных геморрагических лихорадок, и представляет собой новый вариант штамма Сьерра-Леоне вируса Ласса, обладающий высокой вирулентностью для морских свинок.

Штамм Свинка использован при проведении лабораторных исследований по оценке эффективности специфических (вакцины, иммуноглобулины), а также может быть применен для неспецифических (химиопрепараты, интерферон и его индукторы, иммуномодуляторы и других) МСЗ в отношении данной нозологической формы.

Вирус Ласса был впервые выделен в 1969 г. в Нигерии во время вспышки инфекционного заболевания [1-3]. Относится к отряду Mononegavirales, семейству Arenaviridae, роду Arenavirus, группе аренавирусов Старого Света [4]. Вызываемая возбудителем одноименная геморрагическая лихорадка характеризуется высоким уровнем летальности среди госпитализированных больных и представляет серьезную угрозу здоровью населения ряда стран Африки [5].

В Национальной коллекции вирусов геморрагических лихорадок I группы патогенности Вирусологического центра НИИ микробиологии МО РФ депонированы два штамма вируса Ласса, выделенные в Сьерра-Леоне:

штамм Сьерра-Леоне - из сыворотки крови больного человека, взятой на 14 сутки заболевания во время эпидемии 1970-1972 годов, и штамм Джозиа - из сыворотки крови больного (эпидемия 1976 года). Экспериментальное изучение штаммов позволяет сделать заключение о том, что они не отличаются друг от друга по антигенной структуре, репродуктивной способности в культурах клеток и обладают равной степенью патогенности для лабораторных животных.

Для получения штамма Свинка был использован штамм Сьерра-Леоне вируса Ласса.

Необходимость разработки МСЗ против лихорадки Ласса обуславливается возможностью заноса вызывающего ее возбудителя в неэндемичные регионы, в том числе и в РФ. Проверку эффективности средств защиты на стадии доклинического изучения осуществляют с использованием лабораторных животных и культур клеток.

Для оценки эффективности разрабатываемых защитных препаратов в практике вирусологической работы наиболее целесообразно использование низших приматов, поскольку они морфофизиологически и эволюционно наиболее близки к человеку [6]. Эти животные являются высокочувствительными к инфицированию вирусом Ласса, а развитие и проявления основных клинических симптомов вызываемого у них заболевания сходны с таковыми у человека [7-9]. Однако высокая стоимость обезьян не позволяет использовать их в рутинных экспериментах на этапах скрининговой, предварительной или доклинической оценки эффективности разрабатываемых защитных препаратов. Применение для этих целей мелких лабораторных животных наиболее оправдано и позволяет получать статистически достоверные результаты исследований.

Среди восприимчивых к вирусу Ласса лабораторных животных наибольший интерес при решении поставленных задач представляют морские свинки, у которых инфекция сопровождается длительной вирусемией и в 40-60% случаев заканчивается летально [10, 11].

Анализ данных литературы [7, 8, 11] свидетельствует о том, что морская свинка с успехом используется при изучении иммуногенности разрабатываемых вакцинных препаратов, оценки их токсичности, аллергизирующего действия и т.д. Использование этих животных при оценке эффективности МСЗ в отношении вируса Ласса ограничивается отсутствием закономерной гибели морских свинок от величины инфицирующей дозы. Данную задачу может решить получение высоковирулентного для морских свинок варианта штамма вируса Ласса, сохраняющего отдельные биологические характеристики исходного штамма возбудителя.

Целью настоящего изобретения является получение варианта штамма вируса Ласса, обладающего высокой вирулентностью для морских свинок.

Сущность изобретения заключается в том, что в результате проведения пяти последовательных направленных пассажей культуры штамма Сьерра-Леоне вируса Ласса через печень инфицированных морских свинок получен штамм Свинка, отличающийся от родительского штамма высокой вирулентностью для этого вида животных. В процессе проведения пассажей вируса Ласса через печень инфицированных морских свинок закономерно увеличивается доля специфически павших животных и зависимость их гибели от вводимой дозы.

Техническим результатом данного изобретения является то, что полученный штамм Свинка вируса Ласса обладает высокой вирулентностью для морских свинок, вызывая их 100%-ную гибель после подкожного инфицирования в дозе от 10 до 30 БОЕ, что обеспечивает возможность использования данного штамма для проведения лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя.

Для культуры первого пассажа зависимость между дозой возбудителя, вызывающей гибель 50% инфицированных животных, и долей специфически погибших животных выражается коэффициентом корреляции, равным 0,55; для культуры пятого пассажа - 0,91. Величина одной ЛД₅₀ для морских свинок при подкожном инфицировании культурой исходного штамма Сьерра-Леоне превышает 10⁵ БОЕ и не может быть корректно рассчитана ввиду отсутствия зависимости «доза-эффект». Соотношение ЛД₅₀ и БОЕ для культур пятого и последующих пассажей равно 1,0. Зависимость величины ЛД₅₀ культур от уровня их пассажей через печень инфицированных морских свинок описывается уравнением линейной регрессии

lgЛД₅₀=5,67-0,97·R,

где R - количество пассажей.

По другим биологическим свойствам штамм Свинка не отличается от исходного штамма Сьерра-Леоне вируса Ласса.

Пример выполнения

1. Порядок проведения последовательных пассажей штамма Сьерра-Леоне вируса Ласса для получения штамма Свинка представлены в таблице 1.

Таблица 1
Получение штамма Свинка (варианта штамма Сьерра-Леоне) вируса ЛассаПассажБиологическая активность культуры, БОЕ·мл^-1Соотношение ЛД₅₀/БОЕГибель животных при инфицировании от 10 до 30 БОЕ, %Исходная культура (коллекционная)больше 3,0·10⁶больше 1500000I3·10³20000II9,1·10³9038III5,4·10³4545IV1,4·10⁵1564V2,3·10⁵1100VI2,5·10⁶1100VII1,0·10⁶1100

2. Количество пассажей штамма Свинка от родительской культуры

Штамм Свинка получен в результате пяти пассажей исходной коллекционной культуры через печень морских свинок.

3. Стандартные условия приготовления коллекционной культуры штамма Свинка

Морских свинок инфицируют подкожно в дозе от 10 до 30 БОЕ культурой четвертого пассажа вируса Ласса. За животными устанавливают наблюдение. Морских свинок, погибших до 7 суток, в работе не используют. Животных, павших с восьмые по одиннадцатые сутки от момента инфицирования, подвергают вскрытию с соблюдением правил асептики, извлекают печень и готовят 10% гомогенат на 10% растворе сахарозы с добавлением 10% желтка свежего куриного яйца. Полученную культуру разливают по ампулам и лиофилизируют под вакуумом в установке для сублимационного высушивания.

Поддержание жизнеспособности штамма Свинка (варианта штамма Сьерра-Леоне) вируса Ласа гарантировано депонированием культуры в коллекционный фонд ВЦ НИИМ МО РФ (инвентарный №753, культура №130).

4. Свойства штамма Свинка (варианта штамма Сьерра-Леоне) вируса Ласса

Сравнительная оценка биологических свойств штамма Свинка и родительского штамма Сьерра-Леоне вируса Ласса представлена в таблице 2.

Таблица 2
Сравнение биологических свойств культур вируса ЛассаБиологическая характеристикаВирус ЛассаШтамм Сьерра-ЛеонеШтамм Свинка123Формирование негативных колоний на культурах клетокGMK-АН-1(Д) и 6619-1(Д)GMK-АН-1(Д) и 6619-1(Д)Средний размер негативных колоний на клетках GMK-AH-ЦД), 6619-1(Д),мм, х±σ:1,3±0,21,3±0,2Накопление в монослойной культуре клеток GMK-AH-1(Д) на 3 сутки, lg БОЕ·мл^-1, х±σ6,3±0,2^А6,2±0,2^БТитр антител в РН с иммунодиагностикумом к штамму Сьерра-Леоне вируса Ласса1:5121:512Патогенность для беспородных морских свинокСпорадическая гибель с летальностью от 20 до 67% вне зависимости от вводимой дозы вирусаМанифестное заболевание с закономерной от вводимой дозы вируса гибелью животных с летальностью до 100%Концентрация вируса в печени морских свинок: lg БОЕ·мл^-1, х±σ
lg ЛД₅₀·мл^-1, х±σ 
 
5,2±0,2^В
1,4±0,2^Д 
 
5,3±0,3^Г
5,6±0,3^ЕИндекс СБ, lg, х±σМинус 3,8±0,2^Ж0,3±0,3^ЗПатогенность для кроликовПризнаки заболевания при подкожном, внутримышечном, внутривенном способах инфицирования отсутствуютПризнаки заболевания при подкожном, внутримышечном, внутривенном способах инфицирования отсутствуютПримечания1. РН - реакция нейтрализации.2. СБ - Δlg, (ЛД₅₀-БОЕ)3. Различия Д-Е, Ж-З статистически достоверны с уровнем надежности Р=0,05, а различия А-Б и В-Г статистически недостоверны.4. х - среднее арифметическое значение.5. σ - значение среднего квадратического отклонения.

5. Контроль контаминации

Грибковая и бактериальная микрофлора в коллекционной культуре штамма Свинка методом высева на тиогликолиевую среду не выявлена.

6. Количество изученных пассажей культуры штамма Свинка

Изучены культуры двух пассажей штамма Свинка. Доказано сохранение приобретенного полезного свойства варианта - повышенной вирулентности для морских свинок.

7. Способ консервации

В качестве консерванта использован 10% раствор сахарозы с добавлением 10% желтка свежего куриного яйца. Культура сохраняет свои биологические свойства при хранении под вакуумом в лиофильно высушенном состоянии при температуре от 2 до 6°С в течение 1 года.

8. Пример наилучшего использования

Полученная культура штамма Свинка (варианта штамма Сьерра-Леоне) вируса Ласса может быть использована для проведения лабораторных испытаний защитной эффективности МСЗ от данного возбудителя, например, при определении протективных свойств инактивированной вакцины лихорадки Ласса.

Протективные свойства вакцины лихорадки Ласса на предварительном этапе исследований оценивают через 30 суток после заключительной иммунизации морских свинок. В качестве тестирующего инфицирующего материала используют культуру штамма Свинка вируса Ласса.

Инфицирующая доза вируса при проведении испытания составила от 10 до 30 ЛД₅₀. Наблюдение за животными вели в течение 30 суток. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Оценка эффективности вакцины лихорадки Ласса (серия №3) в экспериментах на морских свинкахПоказательГруппа животныхИммунизированныеКонтрольДоля животных с лихорадкой, процент, С±σ15±690±6Доля животных с вирусемией, процент, С±σ15±6100-5Доля специфически погибших животных, процент, С±σ15±6100-5Процент защиты, С±σ85±60Примечание - С - процент животных и величину его ошибки (±σ) рассчитывали по Генес B.C.[12].

Анализ результатов, представленных в таблице 3, свидетельствует о возможности использования штамма Свинка (варианта штамма Сьерра-Леоне) вируса Ласса для оценки протективной эффективности МСЗ против лихорадки Ласса с использованием экономически доступных видов животных - беспородных морских свинок.

Источники информации

1. Atkins J.L. Lassa virus infection //MMWR 1970. -Rep. 19.-P. 123.

2. Carey D.E., Kemp J.E., White H.A. et al. Lassa fever epidemiological aspects of the 1970 epidemic, Jos, Nigeria //Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. - 1972. - Vol. 66, №3. - P. 402 -408.

3. Frame J.D. Balduin J.M., Gocke D.J., Troup J.M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings //Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1970. - Vol. 19, №4. - P.670-676.

4.Virus taxonomy: The classification and nomenclature of viruses /Edd: van Regenmortel MHV et al //Acad. Press, San Diego, 2000.

5. Anonim. Lassa, Junin, Machupo and Guanarito viruses /Encyclopedia of Virology plus. - Acad. Press, 1995 (CD-ROM).

6. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. - Киев, 1983.

7. Peters S.J., Buchmaier M., Rollin P. E., Ksiasek T. G. Arenaviruses /In: Fields virology /Ed B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Powley. -Philadelphia, 1996.

8. Fisher-Hoch S.P., Hutwagner L., Bowen В., McCormic J.B. Effective vaccine for Lassa fever //Virology. - 2000. - Vol. 74, N15. - P. 6777-6783.

9. Walker D.H, Johnson K.M., Lange J. et al. Experimental infection of rhesus monkeys with Lassa virus and a closely related arenavirus Mosambique virus //J. Inf. Dis. - 1982. - Vol. 146, N3. - P. 360-368.

10. Уолкер Д., Вульф Г., Лейндж Дж, и др. Сравнительные патогистологические данные при заражении вирусом Ласса обезьян, морских свинок и Mastomys natalensis //Бюлл. ВОЗ. - 1975. - Т.51, №11. - С.514-525.

11. Маркин В.А., Борисевич И.В., Махлай А.А. Особенности патогенеза вирусных особо опасных геморрагических лихорадок //Патогенетические основы лечения инфекционных болезней. - M., 1999. - С.228-236.

12. Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - М., 1967.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Свинка получен в результате проведения пяти последовательных направленных пассажей культуры штамма Сьерра-Леоне вируса Ласса через печень инфицированных морских свинок. Штамм Свинка обладает высокой вирулентностью для морских свинок, вызывая их 100%-ную гибель после подкожного инфицирования в дозе от 10 до 30 БОЕ, что обеспечивает возможность использования данного штамма для проведения лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя. 3 табл.

Штамм Свинка вируса Ласса, относящийся к роду Arenavirus, № НКВ-23 ВЦ НИИМ МО РФ, предназначенный для лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты.