СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКОЙ ЭБОЛА У ЛИЦ, ПРЕДПОЛОЖИТЕЛЬНО ИНФИЦИРОВАННЫХ УКАЗАННЫМ ВИРУСОМ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к способам ранней диагностики геморрагической лихорадки Эбола и может быть использовано в медицине и вирусологии.

Известно выявление антигенов (вирусных частиц) вируса Эбола в крови, которое осуществляется в конце инкубационного периода или в период разгара заболевания, что соответствует 4-6 суткам с момента инфицирования. Для этого используются следующие методы:

- выделения вируса на культуре клеток и постановки биопробы на чувствительных лабораторных животных

1. Peters et al., 1996: Peters C.J., Sanchez Anthony, Rollin Pierre E. Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. 1161-1176. In: Fields Bernard N., Knipe David M., Howley Peter M. Field's Virology Third Edition Volume 1 1996. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia PA.

2. Saijo et al., 2001: Saijo Masayuki, Niikura Masahiro, Morikawa Shigeru, Kurane Immunofluorescence Method for Detection of Ebola Virus Immunoglobulin G, Using HeLa Cells Which Express Recombinant Nucleoprotein. Journal of Clinical Microbiology. 2001; 39 (2): 776-778. [PubMed: 11158150].

3. Mekki and Van Der Groen, 1981: Mekki A.A., Van Der Groen G. A comparison of indirect immunofluorescence and electron microscopy for the diagnosis of some haemorrhagic viruses in cell cultures. Journal of Virological Methods. 1981; 3(2): 61-69. [PubMed: 7024293].

- выявление РНК вируса в пробах от инфицированного человека методами ПЦР и риал-тайм ПЦР.

1. Leroy et al., 2000: Leroy E.M., Baize S., Lu C.Y., McCormick JB, Georges AJ, Georges-Courbot MC, Lansoud-Soukate J, Fisher-Hoch SP. Diagnosis of Ebola haemorrhagic fever by RT-PCR in an epidemic setting. J Med Virol. 2000; 60(4): 463-467.

2. Drosten et al., 2002: Drosten C., Gottig S., Schilling S., Asper M, Panning M, Schmitz H, Gunther S. Rapid detection and quantification of RNA of Ebola and Marburg viruses, Lassa virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Rift Valley fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. J Clin. Microbiol. 2002; 40(7): 2323-2330. [PubMed: 12089242].

3. Drosten et al., 2003: Drosten C, Kummerer BM, Schmitz H, Gunther S. Molecular diagnostics of viral hemorrhagic fevers. Antiviral Res. 2003; 57(1-2): 61-87. [PubMed: 12615304].

- выявление вирусных частиц методами электронной микроскопии и непрямой электронной микроскопии.

Известно выявление антител в сыворотке крови переболевших людей, которое осуществляется не ранее 3-х сут от момента инфицирования (ранние антитела класса IgM) и появляющиеся на 10-14 сутки антитела класса IgG методами иммуноферментного анализа:

1. Ksiazek et al., 1999: Ksiazek T.G., Rollin P.E., Williams A.J., Bressler DS, Martin ML, Swanepoel R, Burt FJ, Leman PA, Khan AS, Rowe AK, Mukunu R, Sanchez A, Peters С J. Clinical virology of Ebola hemorrhagic fever (EHF): virus, virus antigen, and IgG and IgM antibody findings among EHF patients in Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995. J. Infect Di. 1999; 179 (Suppl 1): S177-S187. [PubMed: 9988182].

2. Merzlikin et al., 1995: Merzlikin N.V., Chepurnov A.A., Istomina N.N., Ofitserov VI, Vorob'eva MS. Development and application of an immunoenzyme test system for diagnosing Ebola fever. Vopr. Virusol. 1995; 40(1): 31-35. [PubMed: 7740786].

3. Leroy et al, 2000B: Leroy E.M., Baize S., Volchkov V.E., Fisher-Hoch SP, Georges-Courbot MC, Lansoud-Soukate J, Capron M, Debre P, McCormick JB, Georges AJ. Human asymptomatic Ebola infection and strong inflammatory response. Lancet. 2000; 355 (9222): 2210-2215. [PubMed: 10881895].

Недостатки известных методов состоят в том, что диагностика заболевания геморрагической лихорадкой Эбола до настоящего времени возможна лишь при обнаружении вирусных частиц в крови на 4-6 сутки с момента инфицирования, что по времени совпадает с завершением инкубационного периода и развертыванием клинической картины.

Известен способ определения in vitro активности комплемента по классическому пути активации при различных заболеваниях (красная волчанка, острая пневмония, бронхиальная астма, ревматоидный артрит), которые могут протекать с вовлечением системы комплемента (патент РФ №2124209, МПК G01N 33/559, опубл. 27.12.1998 г.).

Однако данный способ используется для диагностики заболеваний, симптомы которых уже проявились, и не предназначен для ранней экспресс-диагностики особо опасных инфекций.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ детектирования специфичности активированных лимфоцитов в организме (патент РФ №2343486, МПК G01N 33/53, опубл. 10.01.2010 г.), предусматривающий следующие стадии: а) разбавление антигена или антигенов, способных активировать лимфоциты в организме, средой, содержащей дополнительно к стандартным ингредиентам, используемым для клеточных культур, нейтрализующие антитела против цитокинов, которые могут индуцировать клеточную пролиферацию, и/или цитокины, способные индуцировать апоптоз мононуклеарных клеток или ингибировать активацию клеток или клеточную пролиферацию;

б) приготовление суспензии мононуклеарных клеток, содержащей активированные лимфоциты, предназначенные для тестирования в среде;

в) инкубацию смеси антигена и суспензии, содержащей активированные лимфоциты, полученные на стадиях а) и б), в лунках планшета для клеточных культур; и

г) определение наличия антигенспецифических активированных лимфоцитов путем сравнения различий в детектируемых сигналах, исходящих от тестовых лунок и контрольных лунок планшета. Способ предназначен для диагностики геморрагических лихорадок, в том числе вируса Эбола. Схема определения клеточной активности лимфоцитов: в реакции используется смесь сенсибилизированных лимфоцитов, мононуклеарных клеток человека и коммерческих нейтрализующих антител против различных цитокинов. Время инкубации 20 часов в CO₂-инкубаторе при температуре 37°C. После инкубации в клеточную суспензию вносится прижизненный краситель МТТ. Учет результатов по окрашиванию клеток производится миниридером или в световом микроскопе.

Однако описанный в патенте способ является высокотехнологичным, требует использовать сложное и дорогостоящее оборудование. Метод подготовки компонентов для проведения реакции включает следующие этапы:

- получение клеточных линий, содержащих человеческие антигены HLA и mН способами генной инженерии, занимает несколько недель;

- создание линии В-клеток, клонирование занимает 3-5 недель;

- приготовление специфических антигенов каждого наименования для сенсибилизации человеческих лимфоцитов занимает 1 месяц;

- моноклональные нейтрализующие антитела (Fab-фрагменты IgM) являются дорогостоящими коммерческими препаратами (1 мг каждого препарата стоит от 2000 руб.).

Основной недостаток применения данного способа для ранней диагностики вирусных инфекций (включая геморрагические лихорадки ГЛПС, Ласса, Кьясанурская лесная болезнь, Аргентинская ГЛ, Боливийская ГЛ, Конго-Крымская ГЛ и т.д.) - функциональное изменение лимфоцитов происходит в конце инкубационного периода, т.е. на 3-4-5 - сутки с момента инфицирования, что делает данный способ малоактуальным для ранней диагностики инфекционных заболеваний.

Техническим результатом заявляемого изобретения является более ранняя диагностика (в первые часы после вероятного инфицирования) геморрагической лихорадки Эбола.

Указанный технический результат достигается тем, что способ ранней диагностики заболевания геморрагической лихорадкой Эбола у лиц, предположительно инфицированных указанным вирусом, включает получение первых образцов сыворотки крови из организма через 3-4 часа после его вероятного инфицирования и второе получение - через 15-18 часов после его предполагаемого инфицирования. В каждом образце сыворотки определяют уровень гемолитической активности комплемента (ГАК) любым известным методом и, в случае увеличения показателей ГАК в 1,5-2,0 и более раза в образцах, полученных через 15-18 часов после предполагаемого инфицирования по сравнению с фоновыми значениями (образцы сыворотки, полученные через 3-4 часа с момент предполагаемого инфицирования), констатируют факт инфицирования организма, а при отсутствии или незначительном изменении ГАК констатируют отсутствие инфицирования организма. Уровень ГАК определяют унифицированным методом определения ГАК по гемолизу интактных бараньих эритроцитов при добавлении коммерческой гемолитической антибараньей кроличьей сыворотки.

Предлагаемый нами способ ранней диагностики заболевания геморрагической лихорадкой Эбола технически прост, не требует дорогостоящих компонентов. Общее время проведения исследования, включая подготовительный период, не превышает 3 часов.

На фиг.1 приведены графики изменения ГАК при инфицировании морских свинок активными препаратами летального и нелетального штаммов вируса Эбола (лВЭ и нелетВЭ), инактивированным препаратом ВЭ. На фиг.2. приведен график изменения гемолитической активности комплемента в крови морских свинок в первые 30 ч после заражения лВЭ. Сплошной линией показана средняя активность комплемента, точками показаны результаты измерений активности комплемента у отдельных животных. Разброс результатов титрования каждого образца сыворотки не превышал 10 ЕД. Пунктирными линиями обозначена область нормальных значений активности комплемента, исходя из наших опытных данных. На фиг.3 приведен график изменения ГАК в крови морских свинок при инфицировании морских свинок активными препаратами вирусов герпеса, гриппа и нелетальным штаммом ВЭ. На фиг.4 приведен график изменения ГАК в крови морских свинок при инфицировании морских свинок летальным штаммом ВЭ и ГАК в крови инфицированного человека (ПАВ).

Способ ранней диагностики заболевания геморрагической лихорадкой Эбола осуществляют следующим образом.

У лица, предположительно инфицированного вирусом Эбола, например, допустившего аварию при работе с указанным объектом в исследовательской лаборатории, осуществляют первое взятие образцов сыворотки крови из организма не позднее чем через 3-4 часа после его вероятного инфицирования (для получения фоновых значений ГАК) и через 15-18 часов после его предполагаемого инфицирования. В каждом образце сыворотки уровень гемолитической активности комплемента (ГАК) определяют любым известным методом. Определение ГАК может осуществляться двумя методами:

- определение функциональной активности системы комплемента методом гемолиза интактных эритроцитов барана гемолитической антибараньей сывороткой (коммерческий препарат, стоимость коробки с 5 ампулами сыворотки не превышает 200 рублей, рабочее разведение коммерческой сыворотки 1:300-1:1200, что позволяет использовать 1 ампулу на 50-100 определений);

- определение концентрации компонентов комплемента С₃ в сыворотке крови, исследуется в ИФА с использованием тест-системы для определения фактора C₃ любого производителя (обычно, 1 набор рассчитан на 50-100 определений).

Компоненты реакции могут храниться в холодильнике при температуре +8°C длительный период (от 1 месяца для смеси интактных эритроцитов и до 1 года для коммерческой тест-системы). Время приготовления испытуемых образцов сыворотки не превышает 1 часа, время постановки реакции - не более 1 часа. Общее время проведения исследования, включая подготовительный период, не превышает 3 часов.

Уровень ГАК определяют, например, унифицированным методом определения ГАК по гемолизу интактных бараньих эритроцитов коммерческой гемолитической антибараньей кроличьей сывороткой.

Определение гемолитической активности комплемента в сыворотке крови осуществляли на модельных животных - морских свинках. Оценку гемолитической активности комплемента проводили микрометодом по [Соколов М.И., Синицкий А.А., Ремезов П.И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях. // Ленинград, «Медицина». - 1972. - 216 с] в собственной модификации. Титрование ГАК проводили в полистироловых 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических реакций. Разведения образцов сыворотки готовили в соотношении 1/10, 1/12, 1/15, 1/17, 1/20, 1/25 и далее до 1/120 с шагом 5. В каждую лунку вносили 50 мкл физиологического раствора, 25 мкл разведений комплементсодержащей сыворотки, добавляли 50 мкл гемолитической системы. Гемолитическую систему готовили соединением равных частей 2%-ной взвеси эритроцитов барана и коммерческой антибараньей гемолитической сыворотки. Инкубацию реакционной смеси, состоящей из образцов сыворотки, физиологического раствора и гемолитической системы, проводили в термостате при температуре 37°C в течение 45-60 мин. Учет результатов осуществляли визуально. Последнее разведение сыворотки, в котором еще наблюдался 100%-ный гемолиз эритроцитов, принимали за 1 гемолитическую единицу (ЕД) [Соколов М.И., Синицкий А.А., Ремезов П.И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях. // Ленинград, «Медицина». - 1972. - 216 с.].

В случае роста ГАК в 1,5-2,0 и более раза в парных сыворотках, полученных через 3-4 часа и через 15-18 часов с момента предполагаемого инфицирования, констатируют факт инфицирования организма, а при отсутствии или незначительном изменении ГАК констатируют отсутствие инфицирования организма.

Самое главное достоинство предлагаемого метода в том, что предварительный диагноз геморрагической лихорадки Эбола можно поставить через 18-24 часа с момента предполагаемого инфицирования (в случаях аварий при проведении лабораторных, исследовательских, диагностических работ либо при проведении медицинским персоналом врачебных манипуляций с больными геморрагической лихорадкой Эбола). Все остальные общепринятые методики позволяют поставить предварительный диагноз геморрагической лихорадки Эбола не ранее 4-х суток с момента инфицирования, т.е. в конце инкубационного периода на фоне уже развивающихся клинических проявлений.

Результаты экспериментальных исследований для оценки возможности ранней диагностики геморрагической лихорадки Эбола заявляемым способом.

1. Исследована динамика гемолитической активности комплемента в крови морских свинок при летальной и нелетальной инфекции Эбола, вируса герпеса 2-го типа и гриппа А (Фиг.1).

2. Установлена корреляция динамики нарастания активности комплемента в крови животных с летальностью протекающей инфекции. У животных, демонстрирующих летальную инфекцию, после инфицирования вирусом Эбола гемолитическая активность комплемента стремительно нарастала, и уже через 15 часов с момента инфицирования показатели активности комплемента у 100% морских свинок превышали фоновые значения более чем в 2 раза (фиг.2). К концу 1-х суток начиналось их снижение, которое достигало к окончанию инкубационного периода (3-4-е сутки после инфицирования) исходного уровня и затем снижалось до нуля за 2-3 суток до летального исхода.

3. Инфицирование морских свинок нелетВЭ, а также другими вирусными инфекциями (грипп, герпес), приводит к активизации комплемента лишь в конце инкубационного периода (3-4-е сутки после инфицирования), последующим «платообразным» повышенным уровнем комплемента на период острого течения заболевания и нормализацией показателей ГАК в период выздоровления (фиг.3).

4. Установлена связь между значениями ГАК в крови инфицированных морских свинок и сроками гибели этих же животных. Чем больше показатели ГАК превышают нормальные значения (39,2±5,3 ЕД), тем скорее наступает гибель животного. Выявленная особенность характерна для геморрагической лихорадки Эбола, но не обнаружена у лабораторных животных при других летальных инфекциях (герпес, геморрагическая болезнь кроликов) (табл.1).

5. Исследование сывороток крови человека, заболевшего лихорадкой Эбола, взятых через 18 часов после инфицирования, на 2-е сут и далее 1 раз в сутки весь период заболевания, показало увеличение ГАК через 18 часов с момента инфицирования в 2,25 раза, сохранение повышенных значений на протяжении всего инкубационного периода. После подъема температуры (7-е сутки) было отмечено резкое снижение ГАК: каждые сутки показатели ГАК снижались вдвое, достигли нулевых значений на 11-е сутки с момента инфицирования и оставались такими вплоть до гибели (14-е сутки с момента инфицирования) (фиг.4). Полученные результаты изучения ГАК в сыворотке крови человека, заболевшего и умершего от лихорадки Эбола, полностью совпали с экспериментальными данными лабораторных исследований при моделировании лихорадки Эбола на морских свинках (фиг.4).

Выявленный феномен резкого увеличения ГАК (через 15-18 ч после инфицирования) при летальном течении болезни может иметь прогностическое значение и использоваться для ранней диагностики лихорадки Эбола. Это особенно важно, поскольку биохимические, гематологические сдвиги в периферической крови, свидетельствующие об инфекции, в т.ч. и поражении печени (массивном цитолизе) у морских свинок, инфицированных летВЭ, и у человека появляются либо к концу инкубационного периода (4-5-е суток), либо уже в разгар заболевания (Акинфеева Л.А., Аксенова О.И., Василевич И.В., Гинько З.И., Зарьков К.А., Зубавичене Н.М., Каткова Л.Р., Кузовлев О.П., Кузубов В.И., Локтева Л.И., Рябчикова Е.И. и др. Случай вирусной геморрагической лихорадки Эбола. Ж. «Инфекционные болезни», 2005, т.3, №1, с.85-88).

Таблица 1 Соотношение между показателями ГАК сыворотки крови морских свинок через 18 ч после инфицирования летВЭ и сроками их гибели*. Павшие животные/всего
животных ГАК (ЕД)** Сроки гибели (сутки) 4/20 85,0±3,5 7-8 4/20 77,5±5,5 9 5/20 66, 2±5,9 10-13 4/20 55,0±3,5 16-18 3/20 39,2±5,3 нет гибели Примечание * - коэффициент корреляции составил 0,94. ** - среднеквадратичное отклонение, определяется по формуле Фишера-Стьюдента.

Заявляемый способ актуален в случае вероятного внутрилабораторного инфицирования. Таким образом, предложенный способ раннего подтверждения факта инфицирования человека вирусом Эбола (в течение первых суток) позволит немедленно разворачивать полный комплекс лечебно-профилактических мероприятий.

Изобретение относится к области медицины и вирусологии и может быть использовано для ранней диагностики геморрагической лихорадки Эбола. Способ характеризуется тем, что у лиц, предположительно инфицированных указанным вирусом, осуществляют первый забор образцов сыворотки крови через 3-4 часа и второй забор - через 15-18 часов после предполагаемого инфицирования. Определяют в каждом образце сыворотки уровень гемолитической активности комплемента (ГАК) любым известным методом. В случае роста ГАК в 1,5-2,0 и более раза в течение указанного времени констатируют факт инфицирования организма, а при отсутствии или незначительном изменении ГАК констатируют отсутствие инфицирования организма. Уровень ГАК возможно определить унифицированным методом по гемолизу интактных бараньих эритроцитов коммерческой гемолитической антибараньей кроличьей сывороткой. Использование способа дает возможность более ранней диагностики (в течение первых суток) геморрагической лихорадки Эбола, что позволит немедленно назначить полный комплекс лечебно-профилактических мероприятий. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

1. Способ ранней диагностики заболевания геморрагической лихорадкой Эбола у лиц, предположительно инфицированных указанным вирусом, включающий получение образцов сыворотки крови организма через 3-4 ч и через 15-18 ч после его предполагаемого инфицирования и определение в каждом образце сыворотки уровень гемолитической активности комплемента (ГАК) любым известным методом и, в случае увеличения ГАК в 1,5-2,0 и более раза в течение указанного времени, констатируют факт инфицирования организма, а при отсутствии или незначительном изменении ГАК констатируют отсутствие инфицирования организма.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что уровень ГАК определяют унифицированным методом определения ГАК по гемолизу интактных бараньих эритроцитов коммерческой гемолитической антибараньей кроличьей сывороткой.