Штамм-реассортант аренавирусов Ласса и Мопейя для получения иммунобиологических препаратов Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к разработке лечебно-профилактических препаратов.

Вирус Ласса является этиологическим агентом одноименной геморрагической лихорадки. Ежегодно регистрируется тыс. случаев этой инфекции, которая протекает с тяжелыми клиническими проявлениями и нередко заканчивается летальным исходом.

Этот вирус является высококонтагиозным и высокопатогенным для человека и приматов. Хорошо размножается в культурах клеток почек зеленых мартышек. Под агаровым покрытием образует бляшки со средним диаметром 1,8 мм.

Вирус Мопейя (ранее - Мозамбик) серологически и биохимически близкородственный вирусу Ласса, но в отличие от последнего не вызывает заболевания у человека и приматов. В культуре клеток образует бляшки диаметром до 1,5 мм. В опытах на мышах линии CDA показана высокая степень патогенности и летальности при инфицировании как вирусом Ласса, так и вирусом Мопейя. Кроме того, к вирусу Мопейя высокочувствительны новорожденные белые беспородные мыши, чего не наблюдается для вируса Ласса.

V,

а

v о

Известно использование реассортан- тов различных вирусов в производстве иммунобиологических препаратов.

Цепью изобретения является получе- ьие реассортантного штамма аренавиру- сов Ласса и Мопейя для получения иммунобиологических препаратов.

Это достигается при помощи смешанного культивирования вирусов Ласса и Мопейй1 в культуре клеток Vero с последующим клонированием.

Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов, депонент ГКВ Г 907.

Характеристика штамма.

Название вируса, штамма: вирусы Ласса, Иопейя, реассортантный штамм МЛ-29.

Выделен: 1989 г., Минск, в результате смешанного культивирования вирусов Ласса и Мопейя в культуре клеток Vero с последующим клонированием.

Место в универсальной системе: семейство АРЕНАВИРИДЕ.

Кем выделен: СССР, Белорусский НИНЭМ, Васючков А.Д., Фидаров Ф.М., Лукашевич И.С.

бизико-химические свойства: размер 120-130 нм, РНК-одноцепочечная.

Генетические признаки: геном сегментированный.

Прочие свойства: хорошо репродуцируется в культурах клеток почек зеленой мартышки, вызывает образование бляшек под агаровым покрытием в культуре клеток Vero на 6-7 сут. Размер бляшек до 0,8 мм. Высокопатогенен для сосунков белих беспородных мышей.

Антигенные свойства: в тестах флуоресцирующих антител иммунофермент- ного анализа отмечается специфическое взаимодействие с иммунными поликло- нальными сыворотками к штаммам Джо- - зия, Сьерра-Леоне, Мопейя. В МФА и ИОМ в два раза активнее с гомологичной сывороткой, чем другие штаммы

По своим свойствам штамм МЛ-29 отличается от других штаммов сниженной патогенностью для мышей линии СВА и может быть использован при разработке аттенуированных лечебно-профилактических препаратов.

Примеры, иллюстрирующие способ получения реассортантного штамма МЛ-29

и анализ его свойств. j

Пример 1. Кпонирование вирусов Ласса и Иопейя.

20

25

35

781764

Клонирование вирусов Ласса и По- пейя проводили в культуре клеток Vero путем троекратного пассирования из бляшки в бляшку с последующим накоплением в этой же культуре клеток. Титры исходных вирусов были равны 6,0- 6,51д. Культуру клеток Vpro выращивали в виде монослойной культуры, ис- ,j0 пользуя среду ВМЕ с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коровы. Поддерживающая среда содержала 2% этой же сыворотки .

Пример 2. Получение урожая 15 смешанной инфекции.

Культуру клеток Vero выращивали на дне инсулиновых флаконов и после образования монослоя инфицировали смесью, содержащей равные объемы равных инфекционных доз вирусов Ласса и Мопейя из расчета конечной множественности более 1 БОЕ/клетку для каждого вируса.

Адсорбция продолжалась 1,5 ч при 37°С, после чего монослой трижды отмывали раствором Хенкса и заливали средой поддержки. Зараженную таким образом культуру инкубировали 2k ч при 37°С. Затем клетки и культураль- 30 чую жидкость однократно замораживали и оттаивали. После центрифугирования - при 3000 об/мин надосадочную жидкость использовали в качестве исходного материала для последующего изучения.

Пример 3- Изоляция отдельных клонов.

Вируссодержащую культуральную жидкость, полученную в результате смешанной инфекции, титровали в культуре клеток Vero по методу Tomori, Johnj , son. В качестве покрытия использова- ли агэрозу Фирмы Bio Had (Electroendos- mosis, rij, 0,13). Из агарового покрытия выкалывали бляшки, отстоящие друг от друга не менее чем на два сантиметра. Содержимое индивидуальной бляшки гомогенизировали в среде поддержки с помощью ультразвукового гомогенизатора Vir Tis и использовали для заражения клеток Vero с целью последующего клонирования и накопления.

Пример 4. Отбор реассортан- тов.

В качестве критериев отбора использовали вирусологические: фенотип 55 бляшек и летальность для сосунков белых беспородных мышей линии СВА при внутримозговом заражении животных; молекулярно-биологические: использо40

45

50

517781

вание плазмид pAT/L L18 и PUC/L S7, содержащих индивидуальные участки геномных L- и S-сегментов вируса Ласса.

Пример 5. Использование то- . чечной гибридизации.

Для постановки реакции точечной гибридизации использовали РНК, выделенных из клеток Vero, зараженных исходными родительскими штаммами, также реассортантами. РНК из инфицированных клеток выделяли фенольно-де- тергентным методом и наносили на нит- роцеллюлозные фильтры. РНК прижигали к фильтрам в течение 2 ч при . 80°С. Предварительную гибридизацию и саму процедуру гибридизации выполняли как описано Auperin et al. Отмывку фильтров осуществляли по методу Endre et al., при этом температура отмывки для L-PHK составляла , а для S-PHK - 56° С. Высушенные фильтры экспонировали с рентгеновской пленкой.

Пример 6. Изучение антигену ных свойств штамма МЛ-29.

Антигенную активность штамма МЛ-29 изучали с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА). Используя НМОА, исследовали полученный штамм, а также сыворотку морской свинки, иммунизированной этим штаммом. В качестве положительных контро- лей применяли антигены вируса Ласса и Мопейя, антитела сыворотки морской свинки, иммунизированной культураль-. ными антигенами из вирусов Ласса и Мопейя.

НМФА между штаммом МЛ-29 и гомологической сывороткой, а также сыворотками, полученными к вирусам Ласса (штаммы Джозия и Сьерра-Леоне) и Мо

Q

5

0

5

0

5

0

766

пейя, позволял наблюдать специфическую Флуоресценцию в культуре клеток Vero. Специфичность подтверждалась отсутствием свечения при взаимодействии неиммунных сывороток с вирусом и иммунных с незараженной культурой клеток. Титр антител в сыворотках составлял 1:256-1:512.

Специфическую антивирусную сыворотку получали путем гипериммунизации морских свинок вирусным антигеном, представляющим культуральную жидкость. Схема иммунизации представлена- в таблице.

Пример 7. Изучение протек- тивных свойств штамма МЛ-29.

Для изучения протективных свойств штамма МЛ-29 использовали мышей линии СВА. Животных иммунизировали дважды внутрибрюшинно с интервалом в семь дней. Через 10 дней после последней иммунизации мышам вводили летальную дозу вируса Ласса в мозг. Животных наблюдали в течение 21 дня после введения разрешающей дозы вируса Ласса. В течение этого периода гибели животных не наблюдалось. Штамм МЛ-29 обеспечивал 100% защиту мышей от летальной дозы вируса Ласса.

Таким образом, поставленная цель достигнута. Впервые удалось получить реассортантный штамм вирусов Ласса и Копейя для получения иммунобиологических препаратов.

Формула изобретения

Штамм-реассортант аренавирусов Ласса и Мопейя ГКО № 907 для получения иммунобиологических препаратов.

Использование: медицинская вирусология, в частности разработка лечебно-профилактических препаратов. Сущность изобретения: штамм МЛ-29 получают при смешанном культивировании вирусов Ласса и Мопейя в культуре клеток с последующим клонированием. Он характеризуется следующими свойствами: размер вирионов 120-130 нм, геном - сегментированная одноцепочеч- ная РНК. Под агаровым покрытием штамм образует мелкие бляшки (до 0,8 мм), содержит L-PHK вируса Мопейя и S-PHK вируса Ласса, является высокопатогенным для новорожденных белых беспородных мышей и слабопатогенным для мышей линии СВА, защищает мышей от летальной дозы вируса Ласса. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов, депонент - ГКВ V 907. 1 .