Изобретение относится к иммунологии и вирусологии и может быть использовано в качестве специфического профилактического средства против лихорадки Ласса.
Предшествующий уровень техники.
Лихорадка Ласса – это острое геморрагическое заболевание, эндемичное для регионов Западной Африки, включая Гвинею, Либерию, Нигерию и Сьерра-Леоне. Возбудителем данной лихорадки является вирус Ласса -аренавирус, впервые выделенный в 1969 году в Джосе, Нигерия. Естественным резервуаром вируса Ласса является африканская крыса (Mastomysnatalensis). Первичная инфекция возникает в результате контакта с грызунами, инфицированными вирусом Ласса, а также их экскрементами, кровью или мясом. Затем вирус может передаваться от человека к человеку контактно-бытовым путем.
Лихорадка Ласса проявляется неспецифическими симптомами, подобными многим другим эндемическим заболеваниям в Западной Африке, что затрудняет клиническую диагностику. Начальные симптомы могут включать лихорадку, недомогание, головную боль, боль в горле, миалгию, кашель, боль в груди, боль в животе, тошноту, рвоту и диарею. У 80% инфицированных людей заболевание протекает в легкой форме. Однако, у 20% пациентов развивается тяжелое мультиорганное заболевание, осложненное аномальным кровотечением, генерализованным отеком, респираторной недостаточностью, гипотонией, протеинурией, глухотой, энцефалопатией и / или гипотензией. Хотя общий уровень летальности от лихорадки Ласса достаточно низкий (около 1%), среди госпитализированных пациентов он может достигать 20%.
Известно решение (US20120219576A1) в котором раскрывается создание генетической конструкции для получения вирусоподобной частицы, которая может быть использована для индукции иммунного ответа к вирусу Ласса. При этом, генетическая конструкция может содержать последовательности, кодирующие белок аренавирусной матрицы (Z) и по меньшей мере второй белок, содержащий или состоящий из другого белка аренавируса или его функционального фрагмента или варианта. Второй белок конструкции при этом выбирают из белка-предшественника гликопротеина аренавируса (GPC), нуклеопротеина (NP) аренавируса, гликопротеина-1 аренавируса (GP1), или гликопротеина-2 (GP2) аренавируса.
Известна кандидатная вакцина GEO-LM01 против лихорадки Ласса на основе модифицированного вектора осповакцины Ankara. GEO-LM01 экспрессирует предшественник гликопротеина (GPC) и цинк-связывающий матричный белок (Z) вируса Ласса. При совместной экспрессии GP и Z образуются вирусоподобные частицы (VLP). Однократная внутримышечная доза GEO-LM01 защищает 100% мышей линии CBA/J, зараженных летальной дозой реассортантного вируса ML29 (Mopeia/Lassa) (Maria S.Salvato, Arban Domi, Camila Guzmán-Cardozo, Sandra Medina-Moreno, JuanCarlosZapata, Haoting Hsu, Nathanael Mc Curley, Rahul Basu, Mary Hauser, Michael Hellerstein, and Farshad Guirakhoo. A Single Dose of Modified Vaccinia Ankara Expressing Lassa Virus-like Particles Protects Mice from Lethal Intra-cerebral Virus Challenge. Pathogens. 2019 Sep; 8(3): 133).
Также ведутся разработки живой аттенуированной рекомбинантной вакцины rLASV (IGR/SS) на основе рекомбинантного вируса Ласса, который содержит не кодирующую межгенную область (IGR) малого (S) сегмента генома (S-IGR) как в большом (L), так и в S-сегменте генома. Однократное подкожное введение низкой дозы рекомбинантого вируса полностью защищало морских свинок от смертельной инфекции вируса Ласса дикого типа.(YingyunCai, Masaharu Iwasaki, Daisuke Motooka, David X. Liu, Shuiqing Yu, Kurt Cooper, Randy Hart, Ricky Adams, Tracey Burdette, Elena N. Postnikova, Jonathan Kurtz, Marisa St. Claire, Chengjin Ye, Jens H. Kuhn, Luis Martínez-Sobrido, Juan Carlos de la Torre A Lassa Virus Live-Attenuated Vaccine Candidate Based on Rearrangement of the Intergenic Region. mBio Mar 2020, 11 (2) e00186-20; DOI: 10.1128/mBio.00186-20).
Кроме того, известна кандидатная вакцина против лихорадки Ласса, в которой используются два аденовирусных вектора (на основе аденовируса человека 5 серотипа c делециями в E1 и E2b областях), экспрессирующих ген нуклеопротеина (NP) и ген белка-предшественника гликопротеина (GPC), соответственно. Иммунизация морских свинок данной вакциной обеспечила их выживаемость после заражения летальной дозой вируса Ласса (Maruyama, J.; Mateer, E.J.; Manning, J.T.; Sattler, R.; Seregin, A.V.; Bukreyeva, N.; Jones, F.R.; Balint, J.P.; Gabitzsch, E.S.; Huang, C.; etal.Adenoviral vector-based vaccine is fully protective against lethal Lassa fever challenge in Hartley guinea pigs. Vaccine 2019, 37, 6824–6831).
По оценкам ВОЗ от Лихорадки Ласса ежегодно страдает от 100 тыс до 300 тыс человек, при этом около 5 тыс случаев заканчиваются летальным исходом. Однако несмотря на большое количество исследований в данной области, эффективное средство профилактики пока не разработано.Таким образом, в настоящее время в области техники существует потребность в разработке эффективного средства для индукции иммунного ответа против вируса Ласса.
Осуществление изобретения.
Технической задачей заявленного изобретения является создание средства, обеспечивающего эффективную индукцию иммунного ответа против вируса Ласса.
Технический результат заключается в создании иммунобиологическогосредства на основе аденовирусного вектора для индукции иммунного ответа против вируса Ласса и профилактики лихорадки Ласса.
Указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средстводля индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1.
Кроме того, технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1.
Также технический результат заключается в разработке применения иммунобиологического средства, предусматривающего введение иммунобиологического средства, содержащего вектор на основе human adenovirus 26-го серотипа и/или иммунобиологического средства, содержащего вектор на основе human adenovirus 5-го серотипа в организм млекопитающих в эффективном количестве для профилактики лихорадки Ласса.
Краткое описание фигур.
На Фиг.1
представлена выживаемость морских свинок, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством и контрольной группы, зараженныхвирусом Ласса (адаптированный штамм Сьерра-Леоне) в дозе 100ЛД50.
Ось ординат – выживаемость животных, %.
Ось абсцисс – дни после заражения вирусом Ласса.
Обозначена выживаемость морских свинок, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством в режиме прайм-буст (Ad26-GPC2,5*1010вч/мышь; Ad5-GPC2,5*1010вч/мышь).
Обозначена выживаемость контрольных животных.
На Фиг.2
представлена выживаемость морских свинок, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством и контрольной группы, зараженных вирусом Ласса (адаптированный штамм Сьерра-Леоне) в дозе 20ЛД50.
Ось ординат – выживаемость животных, %.
Ось абсцисс – дни после заражения вирусом Ласса.
Обозначена выживаемость морских свинок, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством в режиме прайм-буст (Ad26-GPC2,5*1010вч/мышь; Ad5-GPC2,5*1010вч/мышь).
Обозначена выживаемость контрольных животных.
Реализация изобретения.
Гликопротеин (GP) вируса Ласса является одним из наиболее перспективных вакцинных антигенов. Он представлен на поверхности вируса и отвечает за его проникновение в клетку. Кроме того, структурный анализ GP показал, что он является основной мишенью для нейтрализующих антител (J. Purushotham, T. Lambe, S. Gilbert. Vaccine platforms for the prevention of Lassa fever. Immunology Letters, V. 215, November 2019, Pages 1-11). Предшественник гликопротеина (GPC) кодируется в s сегменте генома вируса Ласса. Он синтезируется как мембранный белок I типа и далее дважды процессируется пептидазами клетки-хозяина, в результате чего образуется трехмерный гликопротеиновый комплекс(Willard KA, Alston JT, Acciani M, Brindley MA.Identification of Residues in Lassa Virus Glycoprotein Subunit 2 That Are Critical for Protein Function.Pathogens. 2018;8(1):1. Published 2018 Dec 26.). mh887755
На основании сравнительного анализа геномов вируса Ласса, выделенных во время вспышки лихорадки Ласса в Нигерии в 2018 году, была определена консенсусная последовательность гена GPC вируса Ласса. Далее были проанализированы все известные последовательности генома вируса Ласса и определена последовательность гена GPC (ID MH887755), имеющая максимальную гомологию с консенсусной последовательностью. Данная последовательность была оптимизирована для экспрессии в клетках млекопитающих.
На основании последовательности ID MH887755 была разработана экспрессионная кассета SEQ ID NO:1, включающая CMV промотор, оптимизированный ген GPC вируса Ласса (ID MH887755) и сигнал полиаденилирования.
В качестве экспрессионных векторов были выбраны рекомбинантные аденовирусы человека 26-го и 5-го серотипов (humanadenovirus26-го серотипа,humanadenovirus5-го серотипа), которые способны индуцировать устойчивый Т-клеточный и гуморальный ответ, а также показывают высокие профили безопасности.
Таким образом, в результате работы было получено иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1. А также иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Разработка дизайна экспрессионной кассеты.
На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ геномов вируса Ласса (Lassamammarena virus), полученных из образцов клинического материала. Для этого были использованы данные, представленные на сайте https://www.fludb.org/brc/vipr_genome_search.spg?method=SubmitForm&blockId=361166&decorator=arena4. Для анализа использовали нуклеотидные последовательностей CDS GPC (последовательность, кодирующая гликопротеин-предшественник) вируса Ласса, выделенные в период в 2018г в Нигерии. Данные нуклеотидные последовательности были транслированы и на основании белковой последовательности построено филогенетическое дерево. Затем была подсчитана вариабельность аминокислот в каждой позиции. На основании этих данных была получена консенсусная (консервативная) аминокислотная последовательность, которую затем сравнивали с полными последовательностями GPC. По результатам проведенного исследования было определено, что самая близкая к консенсусной последовательности - ID MH887755. Далее последовательность ID MH887755 была оптимизирована для экспрессии в клетках млекопитающих. На основе данной последовательности был разработан дизайн экспрессионной кассеты SEQ ID NO:1, которая включает CMV промотор, оптимизированный ген GPC вируса Ласса (ID MH887755) и сигнал полиаденилирования.
Синтез оптимизированной последовательности гена GPC вируса Ласса осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Пример 2. Способ получения экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа.
С помощью методов генной инженерии экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 была помещена в челночную плазмиду pAd26-Ends, в результате была получена конструкция pArms-26-GPC, содержащая экспрессионную кассету SEQ ID NO:1, а также несущая плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. После этого, конструкцию pArms-Ad26-GPC1 линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии и смешали с рекомбинантным вектором pAd26-only-null, который содержит геном аденовируса человека 26-го серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей. В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида pAd26-only-GPC, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1.
Далее, полученную плазмиду pAd26-only-GPC гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате был получен рекомбинантный аденовирус человека (human adenovirus) 26-го серотипа Ad26-GPC.
Иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса по п.1. содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1 и фармацевтически приемлемый буфер.
Пример 3. Способ получения экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа.
С помощью методов генной инженерии экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 (пример 1) была помещена в челночную плазмиду pAd5-Ends, в результате чего была получена конструкция pArms-Ad5-GPC, содержащая экспрессионную кассету SEQ ID NO:1, а также несущую плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа.
Далее полученную конструкцию pArms-Ad5-GPC линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологи, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too-null, который содержит геном аденовируса человека 5-го серотипа с делецией E1 и Е3 областей генома. В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида pAd5-too-GPC, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с делецией Е1 и Е3 областей и экспрессионную кассету.
На четвертом этапе, плазмиду pAd5-too-GPC гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате был получен рекомбинантный аденовирус человека (human adenovirus) 5-го серотипа Ad5-GPC.
Иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса по п.2. содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1 и фармацевтически приемлемый буфер.
Пример 4. Получение буферного раствора.
Авторами изобретения был подобран состав буферного раствора, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Данный раствор включает:
1. Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис), который необходим для поддержания рН раствора.
2. Хлорид натрия, который добавляют для достижения необходимой ионной силы и осмолярности.
3. Сахарозу, которая используется в качестве криопротектора.
4. Магния хлорида гексагидрат, который необходим в качестве источника двухвалентных катионов.
5. ЭДТА, который используется в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
6. Полисорбат-80, который используется в качестве поверхностно-активного вещества.
7. Этанол 95%, который применяют в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
8. Воду, которая используется в качестве растворителя.
Авторами изобретения было разработано 2 варианта буферного раствора: для жидкой формы иммунобиологического средства и для лиофилизированной формы иммунобиологического средства.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для жидкой формы иммунобиологического средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 1). В каждый из полученных буферных растворов (таблица 1, варианты 1-15) добавляли один из вариантов иммунобиологического средства:
1. Иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1,25*1011вирусных частиц.
2. Иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1,25*1011вирусных частиц.
Таблица 1. Состав экспериментальных буферных растворов для жидкой формы иммунобиологического средства.
группы
Таким образом, была проверена стабильность каждого серотипа аденовирусного вектора, входящего в состав разработанного средства. Полученные варианты иммунобиологического средства в буферных раствораххранили при температуре -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для жидкой формы иммунобиологического средства при температурах -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для жидкой формы иммунобиологического средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ (масс %):
Трис: от 0,1831 масс. % до 0,3432 масс. %;
Хлорид натрия: от 0,3313 масс. % до 0,6212 масс. %;
Сахароза: от 3,7821 масс. % до 7,0915 масс. %;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0154 масс. % до 0,0289 масс. %;
ЭДТА: от 0,0029 масс. % до 0,0054 масс. %;
Полисорбат-80: от 0,0378 масс. % до 0,0709 масс. %;
Этанол 95%: от 0,0004 масс. % до 0,0007 масс. %;
Растворитель: остальное.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для лиофилизированной формы иммунобиологического средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 2). В каждый из полученных буферных растворов (таблица 2, варианты 1-13) добавляли один из вариантов иммунобиологического средства:
1. Иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1,25*1011вирусных частиц.
2. Иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1,25*1011вирусных частиц.
Таблица 2. Состав экспериментальных буферных растворов для лиофилизированной формы иммунобиологического средства.
группы
Таким образом, была проверена стабильность каждого серотипа аденовирусного вектора, входящего в состав разработанного средства. Полученные варианты иммунобиологического средства в буферных растворах хранили при температуре -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для лиофилизированной формы иммунобиологического средства при температурах +2ºС и +8 ºС в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для лиофилизированной формы иммунобиологического средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ:
Трис: от 0,0180 масс. % до 0,0338 масс. %;
Хлорид натрия: от 0,1044 масс. % до 0,1957 масс. %;
Сахароза: от 5,4688 масс. % до 10,2539 масс. %;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0015 масс. % до 0,0028 масс. %;
ЭДТА: от 0,0003 масс. % до 0,0005 масс. %;
Полисорбат-80: от 0,0037 масс. % до 0,0070 масс. %;
Растворитель: остальное.
Пример 5. Проверка экспрессии гликопротеина GP вируса Ласса разработанными экспрессионными векторами в клетках линии HEK293.
Целью данного эксперимента была проверка способности сконструированных рекомбинантных аденовирусов экспрессировать ген GPC вируса Ласса в клетках млекопитающих.
Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37ºС и 5% СО2. Клетки помещали на 35мм2 культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее в чашку добавляли препарат рекомбинантного аденовирусав концентрации 100 в.ч./клетку. Таким образом, были получены следующие группы:
1) Ad26-GPC;
2) Ad26- null;
3) Ad5-GPC;
4) Ad5- null
5) фосфатно-солевой буфер.
Через 2 суток после трансдукции клетки собрали, лизировали в 0,5 мл однократного буфера CCLR (Promega), лизат развели карбонат-бикарбонатным буфером и внесли в лунки планшета для ИФА. Инкубировали планшет в течение ночи +4ºС.
Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл блокирующего буфера, накрыли крышкой и инкубировали 1 час 37ºС на шейкере при 400 об/мин. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку и внесли по 100мкл антител к гликопротеину вируса Ласса (Rabbitanti-LASV GP pAbCat. No.: 0307-001). Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, затем внесли 100 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с биотином. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотов в минуту в течение 1 часа. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 минут, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.
Таблица 3. Результаты эксперимента по проверке экспрессии гликопротеина вируса Ласса в клетках линии HEK293 после добавления разработанных экспрессионных векторов.
Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных разработанными экспрессионными векторами наблюдалась экспрессия гликопротеина вируса Ласса.
Пример 6. Проверка безопасности разработанных вариантов иммунобиологического средства.
Целью данного эксперимента являлась проверка токсичности разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при и внутримышечном введении.
В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.
Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 108в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.
В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:
109в.ч. – увеличенная эффективная доза (ЭД) для мышей в 20 раз;
1010в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;
1011в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;
Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:
1) Ad26-GPC,109в.ч./мышь, 20 мышей;
2) Ad26-GPC,1010в.ч./мышь, 20 мышей;
3) Ad26-GPC,1011в.ч./мышь, 20 мышей;
4) Ad5-GPC,109в.ч./мышь, 20 мышей;
5) Ad5-GPC,1010в.ч./мышь, 20 мышей;
6) Ad5-GPC,1011в.ч./мышь, 20 мышей;
7) плацебо (буферныйраствор), 20 мышей.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животных в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Статистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Таким образом, в ходе проведенной работы определяли безопасность разработанных средств путем оценки острой токсичности. Исходя из полученных данных, можно заключить, что все разработанные иммунобиологические средства безопасны.
Пример 7. Проверка иммуногенности вариантов разработанного иммунобиологического средства.
Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 9 животных, которым внутримышечно однократно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 2,5*1011вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null), не содержащие целевого гена или буферный раствор.
Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-GPC;
2) Ad26-null;
3) Ad5-GPC
4) Ad5-null;
5) Буферный раствор.
Оценка титра антител к GP вируса Ласса в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.
Для иммуноферментного анализа антиген (рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, псевдотипированный гликопротеином вируса Ласса – VSV-GPC), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6),наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 oС в течение ночи.
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин20-фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г KH2PO4, Твин20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером(ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 4.
Таблица 4. Титр антител к GP вируса Ласса в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину вируса Ласса.
Пример 8. Проверка иммуногенности вариантов разработанного иммунобиологического средства.
Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 9 животных, которым внутримышечно двукратно с интервалом 21 день вводили варианты разработанного иммунобиологического средства или их комбинации, в дозе 5*109вирусных частиц/мышь.
Таким образом, были получены следующие группы животных:
1. Ad26-GPC; Ad26-GPC;
2. Ad5-GPC;Ad5-GPC;
3. Ad5-GPC;Ad26-GPC;
4. Ad26-GPC; Ad5-GPC;
5. Ad26-null;Ad26-null;
6. Ad5-null;Ad5-null;
7. Ad5-null; Ad26-null;
8. Ad26-null;Ad5-null;
9. Буферный раствор.
Оценка титра антител к GP вируса Ласса в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.
Для иммуноферментного анализа антиген (рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, псевдотипированный гликопротеином вируса Ласса – VSV-GPC), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6),наносили на 96-луночный планшет в количестве 100нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 oС в течение ночи.
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин20-фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г KH2PO4, Твин20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером(ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 5.
Таблица 5. Титр антител к GP вируса Ласса в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину вируса Ласса.
Пример 9. Оценка длительности гуморального иммунного ответа к гликопротеину вируса Ласса после иммунизации разработанным иммунобиологическим средством.
Целью данного эксперимента являлось определение длительности поствакцинального иммунного ответа после иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства, которую оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови в различных временных точках.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на 2 группы по 8 животных. Экспериментальным животным внутримышечно двукратно с интервалом 21 день вводили Ad26-GPC2,5*1010вч/мышь; Ad5-GPC2,5*1010вч/мышь. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных. На 42, 77, 119 и 147 день эксперимента у опытных и контрольных животных отбирали кровь и далее выделяли сыворотку крови. Для иммуноферментного анализа антиген (рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, псевдотипированный гликопротеином вируса Ласса – VSV-GPC), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6),наносили на 96-луночный планшет в количестве 100нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 oС в течение ночи.
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин20-фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г KH2PO4, Твин20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 6.
Таблица 6. Титр антител к GP вируса Ласса в сыворотках периферической крови испытуемых животных в различных временных точках (среднее геометрическое значение титра антител).
Как видно из представленных результатов антитела к гликопротеину вируса Лассау животных, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством, детектируются как минимум на протяжении 147 дней. При этом максимальный титр антител к гликопротеину вируса Ласса в данном эксперименте наблюдался на 77 день.
Пример 10. Исследование протективной активности разработанного иммунобиологического средства на животных.
Протективную эффективность разработанного иммунобиологического средства против лихорадки Ласса оценивали на модели летальной инфекцииморских свинок, вызванной вирусом Ласса штамм Сьерра-Леоне.
Все животные были разделены на 2 группы по 19 животных. Экспериментальным животным внутримышечно двукратно с интервалом 21 день вводили Ad26-GPC2,5*1010вч/мышь; Ad5-GPC2,5*1010вч/мышь. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных. На 42 день после введения первого компонента, морских свинок заражали вирусом Ласса (адаптированный штамм Сьерра-Леоне) в двух дозах 20 ЛД50 и 100 ЛД50.
По 10 животных из каждой группы использовали для оценки выживаемости. Результаты представлены на фиг.1.Как видно из представленных данных, иммунизация морских свинок вариантами разработанного иммунобиологического средства в режиме прайм-буст обеспечивает 100% выживаемость животных после заражения вирусом Ласса как в дозе 20ЛД50, так и в дозе 100ЛД50.
Остальных морских свинок использовали для оценки вирусной нагрузки в органах инфицированных животных. Для этого на 4, 7 и 10 дни проводили эфтаназию 3 животных из каждой группы, после чего отбирали печень, легкие, селезенку. Для определения инфекционного титра образцы органов гомогенизировали и титровали на культуре клеток VeroC1008.
Результаты эксперимента отражены в таблицах 7-8.
Таблица 7. Подавление вирусной репродукции в органах иммунизированных животных после заражения вирусом Ласса в дозе 20 ЛД50.
*ND – ниже предела детекции (менее 2,7 lg БОЕ/мл).
Таблица 8. Подавление вирусной репродукции в органах иммунизированных животных после заражения вирусом Ласса в дозе 20 ЛД50.
*ND – ниже предела детекции (менее 2,7 lg БОЕ/мл).
Как видно из представленных данных, иммунизация морских свинок вариантами разработанного иммунобиологического средства в режиме прайм-буст обеспечивает снижение вирусной нагрузки в органах животных ниже детектируемого уровня.
Исходя из полученных данных можно заключить, что разработанное иммунобиологическое средство обладает протективными свойствами и обеспечивает снижение вирусной нагрузки в органах инфицированных животных, а также увеличивает их выживаемость.
Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, создание средства, обеспечивающего эффективную индукцию иммунного ответа против вируса Ласса, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность иммунобиологического средства, обеспечивающего эффективную индукцию иммунного ответа против вируса Ласса и его промышленную применимость.
--->
Список последовательностей
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="последовательность.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-10-27">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText/>
<FilingDate>2023-10-27</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>2023-10-27</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>The National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation </ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против вируса Ласса и способ его применения.</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2322</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2322</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagagatctacgcgtatgggacaaattatcacattcttccaggaagtgcctcatgtcatagaagaagtgatgaacattgtcctgattgccctcagccttctggcaatattgaaagggatctacaatgttgccacctgtggcctctttggattggtgtccttccttctcttatgtggaagatcatgctcaacaacttacaaaggtgtttatgagctacaaactctcgagctagacatggcaagccttaatatgacaatgccattatcttgcacaaagaataacagccatcattacatcatggtcggaaatgagactggcttagagctgactttaacaaatacaagtatcatcaaccacaagttctgtaacctttctgatgcacataaaaagaatctttatgaccatgctttaatgagtatcatttcaaccttccacttatccatccctaactttaatcagtatgaagcaatgagttgtgacttcaatggagggaagataagcgttcagtacaacctaagccacacttatgctgtagatgcagctaaccactgtgggaccattgctaatggtgttctccagactttcatgaggatggcttggggtggcagttacatagcacttgattccggaaaagggagctgggattgcataatgacttcctaccaatacttgataatccagaacaccacttgggaagatcactgccagttttctcgcccatcccccatcggttatctggggctgctgtcacaaaggacccgggacatttacatcagtcgaagactccttgggacttttacttggaccctctctgattctgaaggcaatgaaacaccgggggggtattgtctaacaagatggatgctgattgaggctgagttgaagtgctttgggaacacagcagttgcaaaatgcaatgagaaacatgatgaggagttttgtgacatgttgagattgtttgacttcaacaagcaagctataaggaggctgaagacagaagcacagatgagtatccaactgataaacaaagcagtgaacgcattgatcaatgaccagctgattatgaagaatcatttaagagatatcatgggaattccttactgcaattacagcaagtattggtacttgaatcacactgtaacaggtaagacatcgttgccaagatgctggcttgtgtcaaatggttcctacctgaatgagacacatttttctgatgacattgaacaacaagcagacaacatgataacagaactgttgcagaaggagtacatggacaggcaagggaagacacccttagggttagtcgatctttttgtcttcagtaccagtttctatctcattagcatcttcctccacctggtcaaaatcccaactcacagacatgtcataggaaaaccctgccctaaaccacacagactcaaccacatgggcatatgctcatgtggtctgtacaaacatcctggtgtaccagtcaaatggaaaagataggctagataactgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaacgcggatctgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вирусов SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) и SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) (варианты) | 2022 |
|
RU2779634C1 |
| Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей | 2021 |
|
RU2761904C1 |
| Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) | 2021 |
|
RU2743963C1 |
| Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме (варианты) | 2021 |
|
RU2743962C1 |
| Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета к вирусу ближневосточного респираторного синдрома (варианты) | 2018 |
|
RU2709659C1 |
| Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к филовирусам: Ebolavirus и/или Marburgvirus, способ использования иммунобиологического средства | 2021 |
|
RU2760439C1 |
| Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) | 2020 |
|
RU2720614C1 |
| Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 для ревакцинации населения (варианты) | 2021 |
|
RU2744444C1 |
| Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у лиц старше 60 лет и/или имеющих хронические заболевания (варианты) | 2021 |
|
RU2744442C1 |
| Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) | 2020 |
|
RU2731342C1 |
Группа изобретений относится к иммунологии и вирусологии. Создано иммунобиологическое средство, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1. Кроме того, создано иммунобиологическое средство, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1. Группа изобретений обеспечивает эффективную индукцию иммунного ответа против вируса Ласса и профилактику лихорадки Ласса. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 10 пр.
1. Иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1.
2. Иммунобиологическое средство для индукции иммунитета против вируса Ласса, содержащее экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1.
3. Применение иммунобиологического средства по пп.1, 2 заключающееся во введении иммунобиологического средства по п.1 и/или 2 в организм млекопитающих в эффективном количестве для профилактики лихорадки Ласса.
| RU 2022100415 A, 27.07.2023 | |||
| Способ количественного анализа латуни и других содержащих цинк сплавов | 1933 |
|
SU37903A1 |
| RU 2018144745 A, 09.07.2020 | |||
| WO 2019014623 A1, 17.01.2019. | |||
