Штамм вируса Ласса для получения иммунобиологических препаратов Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 

ел

с

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано, например, для создания средств специфической диагностики и профилактики такого высокопато- генного заболевания, как лихородка Ласса.

Вирус Ласса, являющийся этиологическим агентом одноименной геморрагической лихорадки, относится к семейству Arenavlridae. Это заболевание распространено в Африке (до 300.000 случаев в год), однако не исключена возможность заноса его на территорию СССР. Средства специфической профилактики в настоящее время не разработаны, и данное заболевание не контролируется. Учитывая высокую контаги- озность и летаЯьность при лихорадке Ласса, разработка диагностических препаратов и средств специфической профилактики (вакцин) является весьма актуальной. Попытки создать вакцину на основе убитого концентрированного и очищенного вируса не уЁен- чались успехом, так как препарат оказался иммуногенен. С другой стороны, изолироеа- ны штаммы так называемых Ласса-подо- бных вирусов - Мопейя (Мозамбик), Мобала, Иппи, имеющих значительное антигенное родство с вирусом Ласса, однако непатогенных для человека. Иммунизация лабораторных животных вирусом Мопейя предотвращала развитие летальной инфек- v ции. В связи с этим вызывает интерес получение аттенуированного варисгнта вируса Ласса для изучения патогенеза данной инфекции и разработки средств специфической диагностики и профилактики.

К настоящему времени получено значительное количество аттенуироеанмгых (непатогенных) штаммов вирусов. Некоторые из них являются вакцинными: например, известны штамм 17D вируса желтой лихорадки,

VI 00

о

(Я

о о

штамм Сэбина полиовируса и др. Все эти вакцинные вирусы способны к репродукции и в организме привитых стимулируют выработку иммунного ответа, предотвращая развитие заболевания при проникновении в организм хозяина патогенного вируса. Природа аттёнуирования изучена недостаточно. В частности, известно, что аттенуированные штаммы 17D желтой лихорадки, ТС-83 штамм вируса Венесуэльского энцефалита лошадей и др. имеют Несколько аминокислотных замен в структурных и неструктурных белках. Однако эти замены, по- видимому, являются критическими для проявления вирусами патогенное™.

Для вирусов рода Arenavlridae ранее был описан аттенуированный штамм XJC13 вируса Хунин, полученный путем пассирования патогенного вируса на культуре клеток. МА-11 1. Вирус Хунин, являющийся этиологическим агентом аргентинской геморрагической лихорадки, относится к аре- навирусам Нового Света (Латинская Америка), имеющим значительные антиген- мые отличия от вирусов Старого Света - лимфоцитарного хориоменингита, Ласса и др. Путем пассирования на клетках L929 при температуре 25° С получен вариант вируса лимфоцитарного хориоменингита (прото- типный вирус семейства Arenaviridae Hena- тогенный для чувствительных к вирусу ЛХМ лабораторных животных (мыши линии SW- 4-6). Аттенуация была достигнута на 17 пассаже вируса. Однако аттенуированный вариант вируса Ласса не описан, что сдерживает получение средств специфической профилактики и индикации данного особо опасного заболевания.

Цель изобретения - получение штамма вируса Ласса, непатогенного для лабораторных животных используемого для получения специфических антисыворотрк и антигенных препаратов.

Цель достигается путем многократного пассирования предварительно клонированного перекалыванием из бляшки агарового покрытия вируса Ласса (штамм Josiah) в присутствии 1 % анти-Ласеа иммунной сыворотки.

Предложенный новый штамм в патентной и научно-технической литературе не описан. Аттенуированный штамм вируса Ласса депонирован в Государственной коллекции вирусов (ГКВ) Института вирусологии им. Д.Й. Ивановского АМН СССР, г. Москва. Номер депонента ГКВ -В72.

Характеристика штамма. Название вируса, штамма: Вирус Ласса, 25-й пассаж. Место в универсальной системе: семейство

Arenaviridae, род Arenavlrus, аренавирус Ласра.

Штамм получен в 1988 году путем кло- нирования патогенного вируса Ласса, штамм Josiah, трижды с перекалыванием из бляшки агарового покрытия в бляшку, а затем пассирования на клетках перевиваемой линии Vero в присутствии 1 % анти-Ласса иммунной сыворотки морской свинки. Про- ведено 25 пассажей с контролем титров ре- пррдукции на культуре клеток и патогенности для лабораторных животных, чувствительных к исходному вирусу Ласса, штамм Josiah, мышей линии СВА, В резуль 5 тате пассирования вирус утерял способность вызывать летательную инфекцию у лабораторных животных.

Выделен: СССР, Белорусский НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ БССР, То- 0 роп А.В., Красько А.Г., Владыко А.С., Щемер А.А. Физико-химические Свойства: размер вмрионов колеблется от 100 до 300 нм, РНК одноцепочечная.

Антигенные свойства: в тестах иммуно- 5 ферментного и иммунофлюоресцентного анализов полученный вариант вируса Ласса связывался с иммунными поликлональными сыворотками к вирусу Ласса, штамм Josiah. Генетические признаки: геном сегмен- 0 тированный, имеется большой (L) и малый (S) сегменты РНК. Сравнение электрофорег- рамм вирионной РНК пассированного вируса, 25-й пассаж, и вируса Ласса, штамм Josiah., не выявляет различий в подвижно- 5 сти S и I сегментов -.см, фиг,

На электрофореграмме приводится вирионная РНК вируса Ласса, непатогенного

для лабораторных животных (25-й пассаж} в

сравнении с в РНК исходного вируса Ласса,

0 штамм Josiah, и других аренавирусов:

дорожка 1 - в РНК вируса Ласса, штамм Сьера-Леон-е,

дорожка 2 - в РНК вируса Ласса, непа- тогенногб для лабораторных животных, 25- 5 пассаж,

дорожка 3 - в РНК исходного вируса Ласса, штамм Josiah,

дорожка 4 - в РНК вируса Мачупо. Прочие свойства: штамм адаптирован к 0 культурам клеток Vero и 1 929/;вызывает бляшкообразование на 6-7 сутки после заражения на монослое клеток Vero с размером бляшек 2-4 мм.

Свойства полученного штамма иллюст- 5 рируютея следующими примерами.

П р им е р 1. Группе (N1) из 6 мышей линии СВА, 100 % чувствительных к вирусу Ласса при внутримозговом введении, вводили аттенуированный вирус Ласса, 25-й пассаж, в мозг 1000 БОЕ/мышь. Другой

группе (N 2) из 6 мышей данный вирус вводили внутрибрюшинно, 1000 БОЕ/мышь. Третьей группе (N3), 6 мышей, вводили высоколетальный исходный вирус Ласса, штамм Joslah, 1000 БОЕ/мышь. Через семь дней животным всех групп, а также контрольной группы (б мышей) ввели в мозг летательную дозу 1000 БОЕ/мышь исходного вируса Ласса. На 7-8 сутки после заражения все животные в контрольной группе погибли с характерной клинической картиной. В группах N 1-3 все животные выжили и были выведены из опыта через 21 день после заражения (3 инкубационных периода). Таким образом, полученный штамм вируса Ласса, 25-й пассаж, не вызывает гибель мышей чувствительной линии СВА при введении йнутрибрюшинно и интрацеребрально, предотвращает летальную инфекцию при введении летальной дозы вируса Ласса, штамм Josiah.

Пример 2. Две группы беспородных морских свинок из 6 и 10 животных иммунизировали подкожно 10000 БОЕ/животное

Формула изобретения Штамм вируса Ласса ГКВ 872 для получения иммунобиологичесхих препаратов.

. tU

0

5

0

5

аттенуированным вариантом вируса Ласса, 25-й пассаж, затем через 28 дней ввели внутрибрюшинно 100000 БОЕ/животное. Все животные выжили и использовались для получения специфических анти-Ласса сывороток. В двух контрольных группах из 20 и 8 животных при аналогичной схеме введения вируса Ласса. штамм Joslah, погибли 11 (55 %) и 6 (75 %) животных соответственно. Следовательно, полученный штамм вируса Ласса, 25-пассаж, не вызывает гибели беспородных морских свинок, высокочувствительных к дикому вирусу Ласса.

Таким образом, получен непатогенный штамм вируса Ласса который, как видно из вышеприведенных примеров, возможно использовать для получения вирусспецифиче- ских антисывороток и антигенных препаратов на чувствительных к вирусу Ласса лабораторный -животных (мыши,морские свинки и др.): ,в исследованиях патогенеза аренавирусов; для генетических иследова- ний аренавирусов.