СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРБОКСИМИОГЛОБИНА В ГОМОГЕНАТЕ ПОСЛЕДА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и, в частности, к лабораторным способам исследования и может быть использовано для количественного определения карбоксимиоглобина (COMb) в гомогенате последа, рожденного женщиной, подвергшейся во время беременности длительному воздействию окиси углерода в атмосферном воздухе в концентрации, превышающей среднесуточную предельно допустимую концентрацию (ПДК), в период экологического неблагополучия - массивных лесных пожаров.

При благоприятных условиях, когда концентрация окиси углерода в атмосферном воздухе не превышает ПДК, плацента осуществляет барьерную функцию. С увеличением срока гестации при увеличении длительности воздействия окиси углерода, превышающей уровень ПДК в атмосферном воздухе, уменьшается барьерная функция плаценты.

При длительном внутриутробном контакте даже с низкими концентрациями окиси углерода у плода и новорожденного возникают тяжелые повреждения на метаболическом уровне. Неодинаковое распределение окиси углерода в системе мать-плацента-плод объясняется низкой скоростью диссоциации фетального гемоглобина, большим сродством его к окиси углерода по сравнению с гемоглобином взрослого типа; меньшим сродством к окиси углерода миоглобина в эндотелии сосудов ворсин плаценты по сравнению с гемоглобином взрослого типа.

Во время родов роженицу сопровождает легкий ацидоз, при котором диссоциация карбоксигемоглобина (COHb) происходит быстрее, уровень COHb в крови снижается и после ингаляции 100% кислородом, не соответствуя уровню концентрации COHb в крови женщины до наступления родовой деятельности.

У новорожденного при рождении отмечается декомпенсированный метаболический ацидоз, компенсирующийся физиологической транзиторной гипервентиляцией. В крови у новорожденного концентрация COHb снижается после рождения и не соответствует уровню COHb у плода. Уровень COHb в крови у роженицы и ее новорожденного ребенка в первые часы жизни не соответствует уровню COHb в крови у плода и его матери до наступления у нее родовой деятельности и не соответствует клинике хронической внутриутробной окиси углеродной интоксикации у новорожденного. А дальнейшая тактика лечения и прогноз течения раннего периода новорожденности зависит от правильной диагностики.

В случаях, когда нет лабораторных данных о количественном содержании COHb в крови у роженицы и у новорожденного при рождении, врачом может быть расценена тяжесть состояния новорожденного как результат хронической или острой гипоксии, не связанной с воздействием на организм плода окиси углерода. При имеющемся декомпенсированном метаболическом ацидозе изобарическая оксигенация, снижая гипоксию, устраняет ее стимулирующее влияние на дыхательный центр, вызывая дальнейшее снижение легочной вентиляции, вплоть до остановки дыхания.

Количественное определение COMb в гомогенате последа содержит информацию об уровне и длительности воздействия окиси углерода в атмосферном воздухе на организм беременной женщины и ее плод. А также служит дополнительным ранним диагностическим критерием в определении экологически обусловленного заболевания у новорожденного - хронической окиси углеродной интоксикации - и позволяет повысить качество лечения. Даже при низких концентрациях карбоксигемоглобина в крови можно обнаружить COMb в последе. Референтный уровень COMb в гомогенате последа 0,0±0,42%. Уровень COMb в последе в норме ниже 1%, но у злостных курильщиц может достигать 4,6-5,2%. В зависимости от концентрации окиси углерода в атмосферном воздухе, ее экспозиции, уровня карбоксигемоглобина в крови у беременной женщины изменяется концентрация COMb в последе.

При концентрации COMb в последе 2,1-3,1% у женщин изменялась скорость психомоторных реакций; при COMb 3,1-5,2% - отмечалась следующая симптоматика: легкая головная боль, тошнота, головокружение; при COMb 5,2-10,4% - сильные головные боли, общая слабость, расширение кожных кровеносных сосудов; при COMb 10,4-15,6% - сильная головная боль, головокружение, чувство страха, слабость, ощущение пульса в висках, тошнота, рвота, тахикардия. Уровень COMb в последе 26% и более не совместим с жизнью плода и его матери.

Существует способ определения COMb в скелетных мышцах и миокарде трупов людей при отравлении угарным газом. (Крамаренко В.Ф., Собчук Б.А., Гладышевская Т.Н., Сыцянко Г.А. Методические указания о количественном определении карбоксигемоглобина и карбоксимиоглобина. М., 1974). Названный способ является самым близким аналогом - прототипом для заявляемого изобретения.

Недостатками прототипа являются:

1. Невозможность количественного определения COMb у живых людей;

2. Невозможность проведения экспресс-анализа COMb из-за недоступности исследуемого материала;

3. Высокая токсичность способа насыщения раствора окисью углерода;

4. Вес исследуемого материала по прототипу для выделения из него миоглобина, должен быть не менее 50-100 г в связи с низкой скоростью первичной механической обработки в гомогенизаторе;

5. Искажение результатов вследствие отсроченного по времени исследования материала и наличия гнилостных изменений в крови и мышцах умерших.

Задача: количественное определение COMb в последе.

Чтобы произвести количественное определение COMb в последе, необходимо иметь следующие растворы миоглобина: №1, содержащий карбоксимиоглобин, дезоксимиоглобин, оксимиоглобин, метмиоглобин; №2, содержащий дезоксимиоглобин и карбоксимиоглобин; №3, содержащий карбоксимиоглобин. В основе определения оптической плотности растворов №2 и 3 лежат различия в спектрах поглощения дезоксимиоглобина и карбоксимиоглобина. Вся работа: получение гомогената из последа, выделение миоглобина из гомогената, получение раствора миоглобина, определение оптической плотности растворов №2, 3, должна проводиться вдали от источников естественного и искусственного освещения, минимальным контактом с воздухом во избежание диссоциации карбоксимиоглобина.

Задачу осуществляют следующим образом: из последа, хранящегося при температуре +1°С-+5°С не более 2 часов после рождения, берут из парацентральной зоны один кусочек весом 30 г, так как эта зона содержит высокую объемную фракцию сосудов. Послед помещают в гомогенизатор и при скорости 9600 об/мин, в течение 30 с получают гомогенаг в объеме не менее 5,0 мл. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку, установленную в штативе со льдом.

В дальнейшем к гомогенату прибавляют по каплям 1 н. раствор едкого натра, достигая рН 7, контроль производят универсальным индикатором. К полученной жидкости прибавляют 1 мл насыщенного раствора ацетата свинца основного (с соблюдением пропорции, как в прототипе).

Перемешивают жидкость в пробирке и центрифугируют 10 мин со скоростью 5000 об/мин, (полученной опытным путем). К слитой надосадочной жидкости объемом 2,5-3,0 мл прибавляют смесь фосфатов натрия 0,025 г - 0,03 г (получают смесь фосфатов натрия и соблюдают пропорции при прибавлении к надосадочной жидкости, как в прототипе).

Повторно центрифугируют жидкость в течение 5 мин при скорости 5000 об/мин.

Получают прозрачный раствор №1. Раствор №1 вносят в кювету с толщиной слоя жидкости в 1 см так, чтобы между верхним слоем жидкости и крышкой кюветы не было воздуха, прибавляют 3 мг гидросульфита натрия. Перемешивают стеклянной палочкой и при закрытой крышке кюветы определяют оптическую плотность полученного раствора №2 на спектрофотометре СФ-10, СФ-56, КФК-3-01 при зеленом светофильтре при длине волны (λ) 540 нм.

Раствор №3 получают из раствора №1 путем обогащения окисью углерода. Все манипуляции производят в вытяжном шкафу в темноте. В пустой герметичный пенициллиновый флакон вносят шприцом 1,0 мл раствора №1, откачивают из него воздух до «вспенивания» жидкости. В другой пустой герметичный пенициллиновый флакон вносят шприцом концентрированную серную кислоту - 5,0 мл и муравьиную кислоту - 1,0 мл, медленно по каплям, до возникновения сопротивления поршню шприца под воздействием образующейся окиси углерода.

Откачивают окись углерода в тот же шприц, затем вводят ее в течение 5 с (установлено опытным путем) во флакон с раствором №1. Шприц с иглой удаляют из пробки флакона. В течение 10 мин (установлено опытным путем) оксимиоглобин полностью переходит в COMb (раствор №3). Затем в раствор №3 вносят 2 мг гидросульфита натрия для перевода метмиоглобина в дезоксимиоглобин, осторожно взбалтывают флакон и в течение 1 мин пропускают через него окись углерода, набранную шприцом из флакона (с серной и муравьиной кислотами), слегка нагретого над пламенем спиртовки (для увеличения скорости выделения окиси углерода). После насыщения раствора окисью углерода раствор COMb (№3) должен быть прозрачным.

Определяют оптическую плотность полученного раствора №3 на спектрофотометре СФ-10, СФ-56, КФК-3-01, при зеленом светофильтре. В качестве раствора сравнения при всех измерениях используют воду. Оптическую плотность раствора №2 измеряют при длинах волн, равных 540 и 554 нм, раствора №3-540 нм.

Коэффициент перехода восстановленного миоглобина в COMb, К=0,351. Затем рассчитывают содержание COMb в процентах в гомогенате последа. Расчет содержания COMb в гомогенате последа в процентах производят по формуле:

где Р - процентное содержание COMb в гомогенате последа

DCOMb - оптическая плотность раствора №3 при λ=540 нм;

DMbCOMb - оптическая плотность раствора №2 при λ=540;

DMbu - оптическая плотность раствора №2 в изобестической точке при λ=554 нм;

К - коэффициент 0,351.

Контролем служат спектры поглощения растворов миоглобина, полученных из гомогената последов, рожденных от женщин без вредных привычек, с благополучным акушерско-гинекологическим анамнезом, проживавших во время беременности в экологически «относительно» благополучных зонах. Величина ошибки определения COMb составляет ±3% (при концентрации до 20%), ±5% (при концентрациях свыше 20%). Заявляемое изобретение имеет следующие положительные моменты:

- способ дает информацию о количественном содержании COMb в доступном свежем биологическом материале - последе, что дает возможность определить степень повреждения систем новорожденного;

- способ количественный, что позволяет установить динамику хронической окиси углеродной интоксикации;

- способ прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, что делает реальной возможность его использования в практической клинической лаборатории;

- способ позволяет получить исследуемую жидкость без предварительного добавления воды и дополнительного отжима для экстрагирования миоглобина благодаря высокой скорости гомогенизации и отечной стромы последа;

- способ лишен погрешности, связанной с неправильно подобранным режимом гомогенизации и центрифугирования;

- способ позволяет сократить время на определение количественного содержания COMb;

- исследование плаценты позволяет прогнозировать течение раннего периода новорожденности и дает возможность начать раннее этиотропное профилактическое лечение новорожденных из группы высокого риска по развитию той или иной патологии, связанной с хронической окиси углеродной интоксикацией.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки:

- определяя концентрацию COMb в предложенном способе, получают более достоверные результаты при использовании свежего биологического материала, а в прототипе при использовании мышц умерших людей нужно учитывать длительность хранения биологического материала и в случаях поздней смерти - период полураспада и полного выведения COMb. Между концентрацией окиси углерода в атмосферном воздухе и определяемом уровне COMb в мышцах умерших людей в прототипе имеется прямая зависимость, но это относится только к острым отравлениям окисью углерода. Более того, приводимые данные весьма противоречивы. При поздней смерти поступившая окись углерода в значительной степени, или полностью выведена из организма, в результате чего получаемые данные теряют свою информационную значимость.

- заявляемый способ позволяет получить исследуемую жидкость без предварительного добавления воды и дополнительного отжима для экстрагирования миоглобина благодаря высокой скорости гомогенизирования, в результате которой отпадает необходимость использования, как в прототипе, высокой скорости центрифугирования во время выделения миоглобина;

- в прототипе для получения гомогената процесс получения миоглобина более трудоемкий, чем в заявляемом способе, предполагающем меньшую затрату времени;

- в заявляемом способе расходуется меньшее количество материала для получения гомогената, чем в прототипе, что очень важно при малых размерах последа, сопровождающих ту или иную патологию;

- предложенный способ насыщения окисью углерода раствора №3 в заявляемом изобретении уменьшает токсичное воздействие реагентов на врача-лаборанта.

Пример 1. Родильница В., 22 года, подверглась в течение 90 суток до родов воздействию окиси углерода в атмосферном воздухе в концентрации, превышающей среднесуточную предельно допустимую (3 мг/м³) в 2-9 раз (6-27 мг/м³), в период экологической катастрофы - массивных лесных пожаров. Без вредных привычек. Гинекологический и акушерский анамнез не осложнен. Жалобы при поступлении на сильную головную боль, головокружение, чувство страха, слабость, ощущение пульса в висках, тошноту, рвоту, тахикардию. Диагноз родов: Беременность 41-42 недели. Хроническая ФПН (фетоплацентарная недостаточность) II степени. Хроническая внутриутробная гипоксия плода. Фетальная экстрасистолия. Синдром задержки внутриутробного развития III степени, асимметричная форма. Роды I стремительные. Оценка при рождении новорожденного по шкале Апгар 6/8 баллов. Вес при рождении 2200 г. Вес плаценты - 300,0 г. Состояние при рождении новорожденного тяжелое за счет синдрома угнетения центральной нервной системы, нарушения микроциркуляции и метаболических процессов, синдрома дыхательных расстройств I степени, тканевой гипоксии. У новорожденного в крови, взятой из вены пуповины в первые минуты жизни, лабораторно выявлен: компенсированный метаболический ацидоз; фракция карбоксигемоглобина фетального (FCOHb(a)F) - 10%. У роженицы во II периоде родов уровень карбоксигемоглобина (COHb(а)) в крови - 6%. Проба мочи на порфиринурию у новорожденного отрицательная. Морфология последа: дегенеративные дистрофические изменения в парацентральной зоне. ФПН II степени. Учитывая неодинаковое распределение окиси углерода в системе мать - плацента - плод, для получения информации о длительности и уровне воздействия окиси углерода на организм беременной женщины, прогнозирования течения раннего периода новорожденности и выбора правильной тактики лечения проведено дополнительное диагностическое исследование по предложенному способу определения концентрации COMb в гомогенате последа, рожденного исследуемой родильницей. На спектрофотометре СФ-10 записывают спектры поглощения (в области от 450 - до 650 нм) полученных растворов миоглобина: №2 - после прибавления гидросульфита натрия и №3 - после дополнительного насыщения окисью углерода. Используя формулу расчета содержания COMb, вычислили процентное содержание COMb в гомогенате последа, равное 14,04%.

Уровень COMb в гомогенате последа, равный 14,04%, свидетельствует о нарушении барьерной функции плаценты и внутриутробном страдании плода. Содержание COMb в гомогенате последа - информативный показатель, подтверждающий наличие у матери и ее ребенка экологически обусловленного заболевания - хронической окиси углеродной интоксикации.

Переношенная беременность и длительное воздействие окиси углерода в атмосферном воздухе на организм беременной женщины вызывают дегенеративные дистрофические изменения в последе, снижают его барьерную функцию. Факт образования COMb играет определенную роль в патогенезе хронической окиси углеродной интоксикации. Своевременно проведенные диагностика и терапия, направленная на ускорение скорости фотодиссоциации окиси углерода в соединениях с гемоглобином и миоглобином в крови и мышцах новорожденного и выведение лиганда из организма, наряду с применением мембраностабилизаторов и антиоксидантов улучшили течение раннего периода новорожденности и предотвратили пролонгирование патологических изменений в старший возраст.

Пример 2. Новорожденный К., от I нормально протекавшей беременности, нормальных родов в срок 39-40 недель. Мать новорожденного без вредных привычек, в течение 30 суток до родов находилась в зоне экологического неблагополучия - лесных массивных пожаров с превышением среднесуточной ПДК концентрации окиси углерода в атмосферном воздухе в 2-9 раз. Получила в комплексе лечения курс АУФОК (аутотрансфузии ультрафиолетово облученной крови) №5 процедур. При рождении оценка состояния новорожденного по шкале Апгар 8/9 баллов. Вес при рождении - 3500 г, рост - 53 см. Состояние удовлетворительное. Лабораторно: в крови у новорожденного фракция карбоксигемоглобина фетального (FCOHb(a)F) - 5,2%. У роженицы во II периоде родов уровень COHb(а) в крови - 3%. Проба мочи на порфиринурию у новорожденного отрицательная. Учитывая нахождение матери ребенка во время данной беременности в зоне экологического неблагополучия, для исключения экологически обусловленного заболевания - хронической окиси углеродной интоксикации, провели дополнительное диагностическое исследование по предложенному способу определения концентрации COMb в гомогенате последа, рожденного исследуемой родильницей. На спектрофотометре СФ - 10 записали спектры поглощения (в области от 450 - до 650 нм) полученных растворов миоглобина: №2 - после прибавления гидросульфита натрия и №3 - после дополнительного насыщения окисью углерода. Используя формулу расчета содержания COMb в гомогенате последа, вычислили процентное содержание COMb, равное 3%. Уровень COMb в гомогенате последа, равный 3%, свидетельствует о сохранении барьерной функции плаценты и высокой скорости диссоциации COHb в крови у женщины во время беременности в результате проведенного лечения.

Определение COMb в гомогенате последа по предложенному способу имеет важное диагностическое значение в экологически обусловленном заболевании - хронической окиси углеродной интоксикации у новорожденных, и позволяет прогнозировать течение раннего неонатального периода с целью повышения качества лечения.

Изобретение относится к медицине и, в частности, к лабораторным способам исследования и может быть использовано для количественного определения карбоксимиоглобина в гомогенате последа, рожденного женщиной, подвергшейся во время беременности длительному воздействию окиси углерода в атмосферном воздухе в концентрации, превышающей среднесуточную предельно допустимую концентрацию (ПДК), в период экологического неблагополучия - массивных лесных пожаров. Согласно способу количественное определение карбоксимиоглобина в последе проводят путем определения оптической плотности растворов, полученных из гомогената последа, хранящегося при температуре +1°С - +5°С не более 2 часов после рождения. Технический результат: получение информации об уровне и длительности воздействия окиси углерода на организм беременной женщины и ее плод, которая служит ранним диагностическим критерием в определении экологически обусловленного заболевания у новорожденного - хронической окиси углеродной интоксикации, что позволяет повысить качество лечения.

Способ количественного определения карбоксимиоглобина в последе, характеризующийся тем, что из последа, хранящегося при температуре +1-+5°С не более 2 ч после рождения, берут из парацентральной зоны кусок весом 30 г, гомогенизируют при 9600 об/мин 30 с, гомогенат в объеме не менее 5,0 мл переносят в центрифужную пробирку, установленную в штативе со льдом и прибавляют по каплям 1 н раствор едкого натра до рН=7, прибавляют 1 мл насыщенного раствора ацетата свинца основного, перемешивают полученную жидкость и центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин, к 2,5-3,0 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,025 - 0,03 г смеси фосфатов натрия, вновь центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин, получают прозрачный раствор №1, содержащий карбоксимиоглобин, дезоксимиоглобин, оксимиоглобин, метмиоглобин, затем раствор №1 вносят в кювету с толщиной слоя жидкости в 1 см так, чтобы между верхним слоем жидкости и крышкой кюветы не было воздуха, прибавляют 3 мг гидросульфита натрия, перемешивают и при закрытой крышке кюветы определяют оптическую плотность полученного раствора №2, содержащего карбоксимиоглобин и дезоксимиоглобин, на спектрофотометре СФ-10, КФК-3-01 при зеленом сфетофильтре при длине волны λ=540 нм и в изобарической точке при длине волны λ=554 нм, затем в пустой герметичный пенициллиновый флакон вносят шприцем 1,0 мл раствора №1, откачивают из него воздух до вспенивания жидкости, одновременно в другой пустой герметичный пенициллиновый флакон вносят шприцем медленно, по каплям, 5,0 мл концентрированной серной кислоты и 1,0 мл муравьиной кислоты до возникновения сопротивления поршню шприца под воздействием образующейся окиси углерода, откачивают окись углерода в тот же шприц, затем вводят ее в течение 5 с во флакон с раствором №1, шприц с иглой удаляют из пробки флакона, через 10 мин в полученный раствор вносят 2 мг гидросульфита натрия, осторожно взбалтывают флакон и в течение 1 мин пропускают через него окись углерода, набранную шприцем из слегка нагретого над пламенем спиртовки флакона с серной и муравьиной кислотами, получают прозрачный раствор №3, содержащий карбоксимиоглобин, определяют оптическую плотность раствора №3 на спектрофотометре СФ-10, КФК-3-01 при зеленом светофильтре при длине волны λ=540 нм и рассчитывают содержание карбоксимиоглобина (COMb) в процентах в последе по формуле

где Р - процентное содержание COMb в гомогенате последа;

DCOMb - оптическая плотность раствора №3, при λ=540 нм;

DMbCOMb - оптическая плотность раствора №2, при λ=540;

DMbu - оптическая плотность раствора №2 в изобестической точке, при λ=554 нм;

К - коэффициент 0,351.