СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/49 G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам диагностики онкологических заболеваний.

Одна из основных проблем онкологии состоит в том, что никому не удается найти те изъяны в иммунитете онкологических больных, которые делают возможным рост опухолей в организме. Складывается парадоксальная ситуация, когда иммунитет онкологических больных ничем не отличается от здоровых, но при этом в организме у них растет опухоль.

На фоне роста опухоли в иммунитете организма не происходит изменений, подобных тем, которые развиваются при иммунодефицитных состояниях, когда подавлены целые звенья иммунокомпетентных клеток или когда происходит исчезновение каких-либо клеточных рецепторов. Изменения, которые происходят в лимфоцитах организма на фоне роста опухоли, касаются гликозилирования белков (рецепторов) их клеточной мембраны. В этом случае иммунокомпетентные клетки теряют способность реагировать только на опухолевые клетки, тогда как реакция на инфекционные агенты полностью сохранена, т.е. иммунодефицит не развивается.

В настоящее время все методы диагностики онкологических заболеваний по анализу крови основаны на измерении уровня опухольассоциированных антигенов. Опухольассоциированные антигены - это структуры, которые в норме представлены в тканях организма, но их количество в нормальных тканях или незначительно, или расположение их в тканях таково, что в норме в кровь они не попадают. В результате развития онкологического процесса увеличивается количество опухолевых клеток и увеличивается в организме количество опухольассоциированных антигенов, которые экспрессированы на поверхности этих клеток. При гибели и (или) слущивании с поверхности опухоли эти антигены начинают попадать в кровь. Таким образом, эта группа методов диагностики использует структуры, которые расположены на опухолевых тканях и полностью игнорирует те изменения, которые могут происходить в организме в ответ на растущую опухоль.

Известен способ диагностики онкологических заболеваний путем определения содержания малых лимфоцитов (диаметр <7.5 мкм) в крови больных онкологическими заболеваниями (В.И.Говалло и др. "Снижение содержания малых лимфоцитов в крови больных со злокачественными костными опухолями". Вопросы онкологии. 1987 г., том 33, №9, стр.15-21).

Как указывают авторы, снижение их на 40-75% по сравнению со здоровыми людьми наблюдается на фоне роста опухолей.

Однако данный способ отличается большим субъективизмом и зависит от квалификации специалистов. Так, диаметр клеток может меняться в зависимости от изотоничности растворов, скорости фиксации мазков, опыта измерения размеров клеток окуляр-микрометром МОВ-1 и т.д. Вследствие большого субъективизма метода он не нашел широкого применения.

Задачей изобретения является повышение специфичности диагностики онкологических заболеваний и исключение его субъективизма.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что лимфоциты крови обрабатывают меченной флуоресцентным красителем - флуоресцеинизотиоцанатом изоформой лектина гороха, и при снижении числа меченых лимфоцитов более чем на 50% относительно нормы судят о наличии онкологического заболевания.

Способ осуществляют следующим образом.

Лектин гороха выделяют методом аффинной хроматографии на Sephadex G-100. Выделение изоформы лектина гороха с высоким сродством связывания с сахарами является необходимым этапом для повышения специфичности диагностики, так как в противном случае с поверхностью клеток связывались бы изоформы лектина, которые при отмывании клеток от несвязавшегося лектина также удалялись (из-за их низкой константы связывания) с поверхности клеток и это приводило бы к заниженному проценту окрашенных клеток.

Для этого семена гороха перемалывают в мельнице в муку с размером гранул менее 0.1 мм. Затем заливают 4-кратным по весу количеством 0.5% раствора NaCl и настаивают в течение 3 часов при 4°С. Экстракт подкисляют до рН 4,6 с помощью 5N HCl и центрифугируют для удаления осадка при 1500 g в течение 30 мин.

Твердый сульфат аммония (NH₄)₂SO₄ добавляют к супернатанту до достижения 60% насыщения раствора. Выпавший в осадок белок собирают центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. Осадок растворяют в минимальном объеме воды и диализируют строго при 4°С против 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2). Белок, выпавший в осадок во время диализа, также удаляют центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.

Супернатант наносят на колонку с Sephadex G-100 (26×100 см). Несвязавшийся белок элюируют 4 л 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2). Лектин гороха элюируют 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2) с содержанием глюкозы от 0.01 до 0.2М, с шаговым повышением концентрации глюкозы 0.01, 0.05 и 0.2М. Элюированный лектин собирают в три отдельные фракции, которые подвергают диализу против 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2). Белок стерилизуют микрофильтрацией с помощью 0.22μ Millipore фильтра.

Далее проводят мечение изоформы лектина флуоресцеинизотиоцианатом. Мечение изоформы лектина именно этим флуоресцентным красителем необходимо, так как именно флуоресцеинизотиоцианат флуоресцирует от лазерного источника света, который используется в проточном цитофлуориметре.

В данном приборе соединены воедино два блока - оптический прибор с лазерным источником света и мощный компьютер. Клетки анализируемого образца попадают и двигаются в тонком стеклянном капилляре, луч лазера просвечивает этот капилляр и клетки, которые по нему двигаются. В различных направлениях по ходу лазерного луча стоят многочисленные детекторы, которые оценивают прохождение света через клетку, его рассеивание на объекте, отражение, флуоресценцию и т.д.

Компьютер по специальной программе оценивает поступающую информацию и выдает оптические параметры каждой, прошедшей по капилляру клетки, определяя уровень флуоресценции каждой из них, что позволяет измерить количество лектина, связавшегося с клеткой и, следовательно, уровень сахаров на поверхности анализируемой клетки, которые доступны для связывания с данным лектином.

Исходно раствор лектина хранят в 0.15М растворе NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением азида натрия до конечной концентрации 0.1% в концентрации 8 мг/белка на мл. Для мечения берут 0.5 мл раствора и доводят этим же буфером объем до 2.5 мл. Этот объем наносят на колонку PD-10, уравновешенную 0.1М карбонатным буфером рН 9.3. Белок элюируют 3 мл карбонатного буфера. Таким образом получают раствор белка с концентрацией в пределах 0.5-2 мг/мл. 1 мг флуоресцеинизотиоцианата растворяют в 1 мл диметилсульфоксида и добавляют к раствору белка из расчета 25 мкл на 1 мл буфера. Раствор перемешивают и оставляют на ночь при 4°С. По окончании инкубации к раствору добавляют 100 мкл 0.5М раствора хлорида аммония и оставилют в прежних условиях при 4°С на 2 часа. Затем лектин переводят в исходный буфер (0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением азида натрия до конечной концентрации 0.1%) с помощью колонки PD-10, уравновешенной 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением азида натрия до конечной концентрации 0.1%.

Диагностика онкологического заболевания на перевиваемой карциноме Эрлиха

Перевиваемые опухолевые модели позволяют быстро изучить те изменения, которые происходят в организме на фоне роста опухоли. Для этого берут животных одной линии, веса, пола, возраста и части из них перевивают опухоль, а часть используют как контроль. Большинство опухолей уже через две-три недели достигают значительных размеров, в то время как животные без опухоли являются адекватным контролем на те изменения в организме, которые происходят именно на рост опухоли.

На фоне роста карциномы Эрлиха в сыворотке крови мышей появляются для этой опухоли факторы, ускоряющие ее рост в опытах in vivo. Однако природа этих изменений остается неизвестной, так как не удается выявить каких-либо опухольспецифических факторов. Нами было высказано предположение, что этот феномен связан с изменением гликозилирования белков крови и мембран лимфоцитов. С целью подтверждения этого предположения было изучено изменение связывания меченой изоформы лектина гороха с лейкоцитами крови на фоне роста карциномы Эрлиха. Выделенная изоформа лектина обладает способностью связываться с глюкозидом и маннозой, в том числе и входящей в состав полисахаридов при гликозилировании белков.

Способ осуществляют с использованием самцов мышей F₁(CBAxC₅₇BL/6), мышей линии C₅₇BL/6 самцов. В каждой группе используют 10 животных. Клетки карциномы Эрлиха трансплантируют внутримышечно по 10⁶ клеток в 0.2 мл среды RPMI-1640 на мышь. Лимфоциты выделяют из периферической крови мышей на 15 сутки после трансплантации опухоли по стандартной методике в градиенте плотности 1.093. Каждый эксперимент повторяют не менее 3 раз.

Определение экспрессии поверхностных маркеров на поверхности лимфоцитов проводят при помощи меченных флуоресцеинизотиоцианатом лектинов. Оценку специфичности связывания пектинов с клеточной поверхностью подтверждают ингибированием их связывания при добавлении сахаров. Результаты учитывают методом проточной цитофлюорометрии на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, США). Гейт (окно) популяции клеток устанавливают на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. Подобный подход полностью исключает субъективный фактор при проведении анализа, так измерения проводятся детекторами прибора и их показания полностью определяются оптическими свойствами анализируемого объекта. При учете результатов подсчитывают 10000 событий в гейте. Статистическую обработку материала проводят при помощи программного пакета WINMDI 2.8.

Исследовали связывание лектинов с поверхностью лимфоцитов периферической крови интактных мышей и мышей на 20 день карциномы Эрлиха. В таблице 1 приведены усредненные данные по всем сериям экспериментов с различным видимым объемом опухоли от минимального менее 1 мм³ до 5 см³.

На фигуре 1 показано распределение клеток лимфоцитов крови здоровых мышей. По оси абсцисс показано распределение клеток лимфоцитов периферической крови в зависимости от их фронтального светорассеивания, а по оси ординат показано светорассеивание клеток в зависимости от их бокового светорассеивания. Лимфоциты формируют плотное облако, что свидетельствует об однородности рассматриваемых клеток. Выделенная рамка (многоугольник) на фигуре 1 называется гейт, она показывает ту популяцию лимфоцитов крови мышей, которая изучается на предмет связывания их с лектинами. Анализируемые клетки обладают сходными оптическими характеристиками как для контрольных животных, так и для животных-опухоленосителей, что также исключает субъективный фактор в проведении исследования.

На фигуре 2 представлена гистограмма распределения нормальных лейкоцитов крови до их окраски лектином гороха (гистограмма 1) и после окраски ФИЦ-меченным лектином гороха (гистограмма 2). Следовательно, после инкубации с лектином происходит сдвиг гистограммы вправо по оси абсцисс, что свидетельствует об увеличении флуоресценции клеток вследствие связывания с ними меченой изоформы лектина. При этом процент связанных клеток составляет 91,2%. По оси ординат показано число клеток, которые имеют соответствующий уровень флуоресценции.

На фигуре 3 приведены гистограммы лимфоцитов периферической крови животных-опухоленосителей до их окраски изоформой лектина гороха и после окраски. Так же, как в случае с нормальными лимфоцитами, окраска лектином гороха вызывает сдвиг гистограммы вправо. При этом только 21,3% клеток находятся в тех же пределах окраски, тогда как в контроле таких клеток 91,2%. Таким образом процент меченых клеток уменьшился на 69,9% (91,2-21,3=69,9).

Таким образом, окраска меченой изоформой лектина гороха лимфоцитов периферической крови мышей показала, что на фоне роста опухолей наблюдается уменьшение доступности сахаров (гликозида и маннозы) для связывания с лектинами на поверхности клеток. Рассматриваемые изменения гликозилирования мембранных белков могут вызвать нарушение адгезивных свойств лимфоцитов и снижение связывания их с поверхностью опухолевых клеток, что может привести к недостаточности противоопухолевого иммунитета.

Выделенная в соответствии с изобретением изоформа лектина гороха может быть использована для диагностики онкологического заболевания (см. таблицу).

Таблица 1Средний процент меченых клеток у животных без опухолиСредний процент меченых клеток у животных с опухольюУменьшение процента меченых клеток на фоне роста опухоли(в %) (в %) (в %)89+1031+958+9

Изобретение относится к медицине и биохимии. Способ включает обработку лимфоцитов крови меченым флюоресцеинизотиоцианатом изоформы лектина гороха полученной экстракцией измельченных семян гороха раствором хлорида натрия, очисткой переохлаждением, диализом и выделением изоформы колоночной хроматографией на сефадексе и элюцией раствором, содержащим глюкозу, и при снижении числа меченых лимфоцитов более чем на 50% относительно нормы диагностируют карциному Эрлиха. Изобретение обеспечивает повышение специфичности диагностики. 1 табл., 3 ил.

Способ диагностики карциномы Эрлиха путем исследования лимфоцитов крови, отличающийся тем, что лимфоциты крови обрабатывают меченной флюоресцеинизотиоцианатом изоформой лектина гороха, полученной экстракцией измельченных семян гороха раствором хлорида натрия, очисткой переосаждением, диализом и выделением изоформы колоночной хроматографией на сефадексе и элюцией раствором, содержащим глюкозу, и при снижении числа меченых лимфоцитов более чем на 50% относительно нормы диагностируют карциному Эрлиха.