СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ (ЕГО ВАРИАНТЫ) - СПОСОБ ДААБУЛЯ И ВЕЩЕСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1999 года по МПК A61K31/495 C07D237/32 A61H39/00 

Изобретение относится к синтезу нового биологически активного соединения, конкретно с 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион натрия дигидрата (люминола натриевая соль дигидрата), обладающему модулирующей активностью функции системы фагоцитирующих мононуклеаров, которые могут найти применение в медицине, и к способу ранней диагностики злокачественных опухолей органов и тканей с помощью соединения, воздействующего на иммунную систему человека.

Из аналогов заявленного соединения известны производные 5-аминофлагидразида или их фармацевтически приемлемые соли, проявляющие противовоспалительное, противоопухолевое и антитоксическое действие (см. патент Швейцарии N 683965, 1994).

Известно применение в качестве иммуномодуляторов гетероциклических дисульфидов (см. Европейская заявка (EP) N 0194571 A, 1979).

Из аналогов изобретения в части способа ранней диагностики злокачественных опухолей органов и тканей известен метод морфологического исследования, когда производят биопсию предполагаемой опухоли (см. С.Л. Дарьялова, В.И. Чиссов. Диагностика и лечение злокачественных опухолейю. М.: Медицина, 1993, с. 23). Известная методика морфологического исследования позволяет диагностировать опухоль достоверно, но такое обследование проводится, как правило, для подтверждения диагноза, поставленного с помощью других методов исследования и на ранних стадиях заболевания проводится редко, поэтому можно сказать, что при раннем морфологическом обследовании диагноз онкологического заболевания хотя и достоверен, но случаен.

Техническим результатом, достигаемым изобретением, является расширение арсенала средств воздействия на живой организм и в упрощение обнаружения злокачественной опухоли в организме человека на ранней стадии ее развития с помощью средства, воздействующего на иммунную систему человека.

Сущность изобретения состоит в достижении упомянутого технического результата с помощью описываемой новой люминола натриевой соли дигидрата формулы I

И в способе ранней диагностики злокачественных опухолей органов и тканей, при котором проводят акупунктурную диагностику органов и тканей, вводят вещество согласно изобретению, повторно проводят акупунктурную диагностику через 3 - 60 минут и при снижении диагностических показателей ниже нормы диагностируют наличие злокачественной опухоли, а также в способе ранней диагностики злокачественных опухолей органов и тканей, при котором проводят сегментарную электродиагностику органов и тканей, вводят вещество согласно изобретению, повторно проводят сегментарную диагностику через 3 - 60 минут и при снижении диагностических показателей ниже нормы диагностируют наличие злокачественной опухоли.

Соединение формулы (I) представляет собой порошок белого цвета с кремовым оттенком, хорошо растворимый в воде и не растворимый в органических растворителях, таких как спирт, эфир, ацетон, хлороформ, сгорающий в пламени спиртовки с образованием золы.

Эмпирическая формула - C₈H₁₀N₃О₄Na.

Молекулярная масса - 235 у.е.

Температура разложения - 270^oC.

Зола - в пересчете на Na - 10,5%.

Магнитный резонанс - характерные сигналы при 6,9, 7,3, 7,47, 149, 161, 162 м.д.

pH раствора - 8,0 - 9,4.

Структура соединения подтверждена данными ИК- и ЯРМ-спектрометрии, масс-спектрометрии pH-метрии.

Вещество получают следующим образом:
5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион подвергают взаимодействию едким натрием в водной среде:

Испытания (in vitro) показатели иммуномодулирующий эффект вещества (5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион-натриевая соль дигидрата)
В качестве испытуемых клеток были использованы лимфоциты и сегментоядерные лейкоциты периферической венозной крови 10 взрослых доноров в возрасте 25 - 40 лет.

Лимфоциты были получены стерильно с помощью градиента плотности фиколл-верографин (d - 1077), трижды отмыты средой 199 и доведены до необходимой для каждого из нижеперечисленных тестов концентраций. В случае постановки реакции бласттрансформации (РБТ) и оценки активности естественных киллеров (ЕК) использовались т.н. "полная" среда следующего состава: среда RPMI - 1640 +10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной при +56^oC + глютамин + гентамицин в общепринятых концентрациях.

1. Оценка влияния различных концентраций вещества на жизнеспособность лимфоцитов.

К 1х10⁶ лимфоцитов в 1 мл "полной" среды прибавляли от 1g до 100g вещества. Затем клетки инкубировали при +37^oC в течение 24 часов. Оценка жизнеспособности клеток проводилась путем прибавления к суспензии лимфоцитов 0,01% раствора трипамового синего с последующей инкубацией клеток при комнатной температуре в течение 10 мин. Мертвые клетки окрашивались в синий цвет. Контрольные пробирки не содержали вещества.

Вывод: во всех испытанных концентрациях вещество не оказывало никакого отрицательного влияния на жизнеспособность лимфоцитов: опыт - 95% живых клеток, контроль - 96% живых клеток.

2. Влияние препарата на экспрессию T-лимфоцитами человека рецепторов к эритроцитам барана.

К 1х10⁶ лимфоцитов в 1 мл среды 199 прибавляли вещество в дозе 1j, 10j, 100j после чего клетки инкубировали в течение 1 часа при +37^oC. Затем лимфоциты трижды отмывали средой 199 от вещества путем центрифугирования клеток при 1500 об/мин по 5 мин при +4^oC. После этого к лимфоцитам - 100 ml прибавляли 100 ml 1% взвеси эритроцитов барана, центрифугировали при комнатной температуре в течение 5 мин, после чего подсчитывали число т.н. "активных" T-лимфицитов (a-POK), т.е. клеток, образующих спонтанные розетки с эритроцитами барана в "некомфортабельных" условиях, или, точнее, несущих высокоаффинные рецепторы к эритроцитам барана. По мнению автора этой методики данная субпопуляция T-лимфицитов человека хорошо коррелирует с противоинфекционным и противоопухолевым иммунитетом, т.е., чем больше число таких розеток, тем лучше состояние пациента.

Вывод: вещество усиливает экспрессию высокоаффинных рецепторов к эритроцитам баранa на T-лимфоцитах человека в дозе 1j и 10j на 1х10⁶ клеток (контроль - 30% a-POK, опыт - 48% a-POK). В дозе 100 j на 1х10⁶ лимфоцитов вещество угнетало процесс активного розеткообразования (8% a-POK). В той же концентрации вещество блокировало образование т.н. "поздних" розеток лимфоцитов человека с эритроцитами барана (контроль - 60%, опыт - 36%).

3. Влияние вещества на экспрессия B-лимфоцитами человека рецепторов в третьему компоненту комплемента (EAC - POK)
К 1х10⁶ лимфоцитов в 1 мл среды прибавляли вещество в дозе 100j, 50j, 25j. Дальнейшие условия инкубации и отмывки клеток от вещества не отличались от вышеописанных. Затем к 100 ml суспензии лимфоцитов прибавляли 100 ml 1% комплекса антиген (эритроцит быка) + антитело (против этого типа эритроцитов) + комплемент. Клетки центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. После 30 мин инкубации приборок при +4^oC подсчитывали число розеток.

Вывод: в дозах 100j, 50j, 25j на 1х10⁶ лимфоцитов вещество достоверно увеличивало число лимфоцитов, имеющих на своей поверхности рецепторы к третьему компоненту комплемента (EAC - POK): контроль - 8% EAC - POK, опыт - 14% EAC - POK.

4. Влияние вещества на цитотоксичность, опосредованную естественными киллерами.

В лунки 96-луночного круглодонного плейта помещали по 1х10⁵ лимфоцитов с 1j, 10j, 25j, 50j, 100j вещества. После этого труда прибавляли клетки - мишени эритролейкоза человека K - 562, меченные Cr51 так, чтобы соотношение между эффектором и клеткой - мишенью составляло 50:1. После этого плейты центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, и инкубировали 16 часов при +37^oC во влажной атмосфере 5% CO₂. Затем плейты повторно центрифугировали, отбирали супернатант и подсчитывали радиоактивность образцов на g-счетчике. Индекс цитотоксичности определяли по формуле:

где (CPM) - число импульсов в минуту.

Вывод: в дозах от 1j до 100j на 1х10⁵ лимфоцитов (1J, 10j, 25j, 50j, 100j) вещество не влияло на цитотоксичность, опосредованную естественными киллерами. (И.ц. в контроле 36%, в опыте - 38%).

5. Влияние вещества на бласттрансформацию лимфоцитов.

В лунки круглодонного плейта стерильно помещали по 10⁵ лимфоцитов. В часть из них (триплет) прибавляли вещество в дозе от 1j, до 100j (1j, 25j, 50j, 100j), другие лунки служили контролем. Кроме того, в ряде случаев лимфоциты были стимулированы T-клеточным митогеном - Кон-A (1j на 10⁵ клеток) - без дополнительного прибавления вещества. После этого плейты инкубировали в течение 72 часов при +37^oC во влажной камере при 5% CO₂. За 4 час до конца инкубации в лунки прибавляли по 1 ml 3H - тимидина, после чего клетки отсасывали с помощью харвестера на фильтры, которые последовательно обрабатывались 5% трихлоруксусной кислотой, 100% этанолом. Подсчет радиоактивности проводили в жидком сцинтилляторе на b-счетчике. Индекс стимуляции (и.с.) вычисляли по формуле:

где (CPM) - число импульсов в минуту, подсчитанное на b-счетчике.

Вывод: вещество может вызывать и блокировать реакцию бластрансформации лимфоцитов. При этом в дозах от 100g до 50g на 10⁵ лимфоцитов оно большей частью препятствует пролиферации клеток, а в дозах от 25j до 1j на 10⁵ лимфоцитов оно может оказывать заметный стимулирующий эффект, приближающийся в ряде случаев к эффекту такого известно T-клеточного митогена как Кон-A.

6. Оценка влияния препарата на фагоцитоз, опосредованный нейтрофильными лейкоцитами человека.

Для оценки фагоцитоза использовали цельную гепаринизированную кровь от 10 здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет. В качестве фагоцитируемых частиц использовали латекс с D = 1,43 мкм. Перед постановкой теста последний трижды отмывали дистиллированной водой при 3000 об/мин по 5 мин. Получали 0,1 мл плотного осадка, к которому добавляли 0,5 мл дист. воды. 100 ml частиц латекса из этого маточного раствора после тщательного перемешивания добавляли к 4 мл среды 199 (рабочий раствор), который использовали для постановки теста. К 0,05 мл гепаринизированной крови, предварительно инкубированной с различными дозами вещества в течение 1 часа при температуре +37^oC и трижды отмытой средой 199, прибавляли 0,05 мл частиц латекса из рабочего раствора в круглодонные плейты, перемешивали и инкубировали 1 час при +37^oC. После этого делали обычным способом мазки крови, высушивали их на воздухе в течение 15 мин, фиксировали 3 мин в абсолютном метаноле, высушивали при комнатной температуре и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Затем подсчитывали количество нейтрофилов, фагоцитировавших частицы латекса (фагоцитарное число). Результаты выражали в процентах на 100 нейтрофилов.

Вывод: дозах 1j, 5j, 10j, на 1х10⁵ клеток вещество заметно увеличивает количество нейтрофильных лейкоцитов, фагоцитировавших частицы латекса: контроль - 55%, опыт - 75%.

Таким образом вещество согласно изобретению в ряде случаев может вызывать заметный модулирующий эффект на иммунокомплементные клетки человека. Это прежде всего касается повышения числа высокоаффинных рецепторов к эритроцитам барана на T-лимфоцитах, увеличения экспрессии рецепторов к C3 компоненту комплемента на B-лимфицитах. В дозах от 25j до 1j на 1х10⁶ лимфоцитов вещество оказывает заметный стимулирующий эффект на процесс бласттрансформации клеток, а в количестве 1j, 5j, 10j на 1х10⁶ лейкоцитов вещество заметно увеличивает фагоцитарное число нейтрофильных лейкоцитов.

Способ ранней диагностики злокачественных опухолей органов и тканей с помощью вещества согласно изобретению осуществляют следующим образом: проводят акупунктурную (по Фоллю) или сегментарную (по Pflaum) электродиагностику (см. Лупичев Н.Л. Гомеопатия и энергоинформатика. М., 1994 г., фирма "РОИ", стр. 16-25; Pflaum, H.: Praktikum der Bioelektronischen Funktions und Reguliations diagnostik /BFD/. HF. Heidelberg, 1979, S. 1-137), фиксируют диагностические показатели, внутримышечно вводят вещество согласно изобретению в дозе 10 - 200 мг и через 3 - 60 минут повторно снимают диагностические показатели по ранее используемой методике. При снижении показателей ниже нормы диагностируют злокачественную опухоль. Время повторного определения диагностических показателей определяется временем, достаточным для выброса фактора некроза опухоли под действием введенного вещества и поэтому в зависимости от стадии процесса и локализации опухоли может быть различным.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Больная А., обратились по поводу общего обследования по методу Фолля с предварительным диагнозом мастопатия. При первичном измерении показатели точек молочной железы были зафиксированы по шкале прибора в пределах 65 - 80 единиц, что косвенно свидетельствовало о наличии мастопатии. При пальпации молочных желез узлов не обнаружено. Пациентке было внутримышечно введено вещество согласно изобретению и через 15 мин повторно сняты диагностические показатели. На точках левой молочной железы зафиксировано падение показателя до 20 единиц, что свидетельствовало о наличии злокачественной опухоли. Пациентке было рекомендовано обратиться к маммологу. Дальнейшие исследования подтвердили поставленный диагноз.

Пример 2. Больной Б., обратился с предварительным диагнозом - аденома предстательной железы. Первичное обследование по методу Фолля показало на точках предстательной железы 52 и 50 единиц, что соответствовало норме. После введения препарата повторные измерения были проведены через 25 мин, при этом показатели предстательной железы упали до 42 и 40 единиц соответственно, что свидетельствовало о наличии злокачественной опухоли на ранней стадии развития. Дальнейшее обследование подтвердило поставленный диагноз.

Пример 3. Больной В. , обратился для обследования по методу Фолля. Из анамнеза известно, что у него ранее удалена меланома на спине и позднее - лимфатический узел в левой подмышечной области. Гистологические исследования показали наличие метастаза меланомы в удаленном лимфатическом узле. Больному был проведен курс химиотерапии. Показатели первичного обследования по методу Фолля на точках некоторых органов в пределах нормы, а в других органах имела место токсическая нагрузка (показатели до 80 единиц). При повторном измерении после введения вещества (через 15 минут после внутримышечного введения) было зафиксировано падение стрелки до 10 единиц на контрольной точке измерения левого лимфатического меридиана, на ОСТИ лимфатических сосудов и узлов легких, на ОСТИ лимфатической системы, что свидетельствует о наличии метастазов в данных областях. Дальнейшие обследования подтвердили поставленный диагноз.

Пример 4. Больной Г., с предварительным диагнозом язва желудка был обследован по методу Фолля. Первичное обследование показало на точках желудка 85 и 82 единиц. После внутримышечного введения препарата через 30 минут были проведены повторные замеры, при которых показатели точек желудка соответствовали 40 и 45 единиц, что свидетельствует о наличии злокачественной опухоли на ранней стадии ее развития. Дальнейшие обследования подтвердили поставленный диагноз.

Пример 5. Больная Д., обратилась для обследования по поводу уплотнений в правой молочной железе. Проведено первичное тестирование по методике Pflaum, при котором диагностические показатели всех органов и тканей соответствовали норме. После введения препарата через 50 минут проведено повторное тестирование, при котором выявилось падение двух показателей, соответствующих молочной железе ниже нормы до 30 единиц, что свидетельствовало о раке молочной железы. Дальнейшее исследование подтвердило поставленный диагноз.

Пример 6. Больной Е., обратился для регулярного обследования. При первичном тестировании по методу Pflaum показатели в пределах нормы, при повторном - через 5 минут после введения вещества - снижение показателей, соответствующих поджелудочной железе, ниже нормы, что свидетельствовало о раке поджелудочной железы на ранней стадии развития. Дальнейшее обследование подтвердило диагноз.

Способ согласно изобретению позволяет определить наличие злокачественной опухоли на ранней стадии развития, что весьма затруднительно даже при морфологическом исследовании. Способ прост в осуществлении, не требует больших затрат времени, позволяет точно определить функцию органа, наличие у него опухоли на ранней стадии развития, выявить скрытую патологию, оценить резервные возможности восстановления утраченных функций.

Использование: в медицине, в частности в качестве вещества - модулятора функции системы фагоцитирующих мононуклеаров в способе ранней диагностики злокачественных опухолей органов и тканей. Продукт (порошок) имеет хорошую растворимость в воде, является малотоксичным, при осуществлении способа вводится внутримышечно после акупунктурного или зонального тестирования. При снижении показателей тестирования после введения вещества диагностируют наличие злокачественной опухоли. 3 с. и 1 з.п. ф-лы.

1. Способ ранней диагностики злокачественных опухолей органов и тканей, отличающийся тем, что проводят акупунктурную диагностику органов и тканей, вводят 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион натрия дигидрата (люминола натриевая соль дигидрата) формулы I
,
повторно проводят акупунктурную диагностику через 3 - 60 минут и при снижении диагностических показателей ниже нормы диагностируют наличие злокачественной опухоли. 2. Способ ранней диагностики злокачественных опухолей органов и тканей, отличающийся тем, что проводят сегментарную электродиагностику органов и тканей, вводят 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион натрия дигидрата (люминола натриевая соль дигидрата) формулы I, повторно проводят сегментарную диагностику через 3 - 60 мин и при снижении диагностических показателей диагностируют наличие злокачественной опухоли. 3. Соединение 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион натрия дигидрата (люминола натриевая соль дигидрата) формулы I

4. Соединение по п.3, обладающее модулирующей активностью функции системы фагоцитирующих мононуклеаров.