Способ получения цитотоксических к раковым клеткам лимфоцитов и способ получения гликосвязанного антигена Советский патент 1988 года по МПК A61K39/00 

1чЭ

сд

;о

Од

Изобретение относится к иммунологии и онкологии. Цель изобретения повьшение противораковой активности лимфоцитов. Раковые клетки промьшают и обрабатывают буфером, содержащим . Тритон Х-100. Смесь подвергают ультрацентрифугированию. Супернатант .пропускают через колонку, заполненную иммобилизованным лектином. После промьшки колонки проводят элюирова- ние. Элюат диализуют и получают гли- косвязанный антиген. Лимфоциты из селезенки мыши после обработки куль- туральной средой добавляют к глико- связанному антигену и культивируют в течение 2 дней. Затем в течений 7 дней проводят культивирование в среде, содержащей фактор роста Т-клеток. Способ позволяет повысить цитотокси- ческую активность лимфоцитов против раковых клеток до 38%. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл. СО

см

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и онкологии, и может быть использовано при. получении цитотоксических к раковым клеткам лимфоцитов и при получении гликосвязанного антигена (GRA) для . сенсибилизации лимфоцитов, направленных против опухолевых клеток, содержащих гликосвязанный антиген.

Цель изобретения - повышение противораковой активности лимфоцитов.

Пример 1, Получение фактора роста Т-клеток (препарата TCGF).

Селезенку (4 кг) японских обезьян

полученных от компании Japan Plyma- tes Со. Ltd, подвергают иссечению и дважды промывают культуральной средой RPMI-1640. Промытые клетки отфильтровывают с помощью ультрафильтра (размер пор равен 150 меш) и подвергают центрифугированию по методу удельно- весового центрифугирования (удельный вес 1,076), в результате чего полу- чают 2л 2-10 на 1 мл лимфоцитов. Полу-; ченные таким образом лимфоциты про- ьшают три раза культуральной средой RPMI-164b и концентрацию лимфоцитов доводят до 5-10 на 1 мл путем использования той же среды, содержащей 10% PCS. Затем эту систему оставляют в аппарате для ферментации в атмосфере углекислого газа при 37 С на период, равный 1 ч. Супернатант- ные (недосадочные) лимфоциты выделяют и доводят концентрацию (число) лимфоцитов до 1-10 на 1 мл путем использования той же культуральной среды, содержащей 1% FCS, После этого туда добавляют 1 мкг/мл индомета- цина и 0,2% РНА-Р (РИА - фитогемаг- глютинин) и лимфоциты культивируют в ферментационном аппарате в атмосфере углекислого газа при 37 С в течение 48 ч. Далее проводят операцию отделения с помощью центрифугирования (3000 об/мин), которое продолжают в течение 10 мин, полученную в итоге супернатантную жидкую фазу отделяют и подвергают стерилизации посредством фильтрования через ультрафильтр (диаметр пор равен 0,2 мк), в результате чего получают 2 л фактора роста Т-клеток (TCGF),

Источник TCGF представляет собой супернатант смещанньк культур лимфоцитов периферической крови от 10 здоровьк доноров. Неприкрепившиеся лимфоциты, полученные из C.F, от

деленных адсорбцией .на пластмассовой поверхности при 37 С в течение 1 ч, суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 1% FCS (1,5-10 клеток/мл) и инкубируют с 0,2%-ным РНА-Р, индо- метацином (1 мг/мл) и линией В-кле- ток человека ,/ВТ-1) (1,5-10 клеток/мл) , предварительно обработанных митомиц1 ном С (50 мг/мл). По прошествии 48 ч супернатант культуры собирают и используют в качестве источника TCGF.

ПЬлучение лимфоцитов периферичес0

5

0

5

0

5

0

5

50 мл крови, полученной от здорового взрослого человека или различных раковых больных посредством ге- паринизации, подвергают центрифугированию путем использования Фиколла (Ficoll Pack), в результате чего получают 5-10 лимфоцитов периферической крови человека.

Получение лимфоцитов из селезенки МЫШИ;

Селезенку породы СЗН (сам- цы, 6W) подвергают иссечению и дважды промьшают культуральной средой RPMI-1640, Затем ткань селезенки раз- . рыхляют иглой шприца и пропускают через сито из нержавеющей стали (100 меш) с целью удаления крупных, кус очков. Отфильтрованные таким образом клетки дважды промывают той же культуральной средой и подвергают центрифугированию при 1200 об/мин в течение 10 мин, в результате чего получают 4.10 лимфоцитов селезенки.

Гликосвязанный ajiTHreH (GRA-1), содержащий белка 40 мкг/мл и сахара 7,5 мкг/мл5 разбавляют в 1000 раз по сравнению с первоначальным объемом культуральной средой RPMI-T640, содержащей 15% FCS, с целью получения сенсибилизационной культуральной

Ср1:,ДЫ.

Лимфоциты периферической крови человека (5-10/5 мл) прибавляют к 5 мл сенсибилизационной культуральной среды, которую помещают в лабораторную чашку Петри, и культивируют при 37 С в течение 2 дней. Затем лимфоциты подвергают дальнейшей культивации в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 20% TCGF (фактор роста Т-клеток) и 15% FCS, еще в течение ,5 дней, в результате чего гюлучают 20 мл раствора клеток-киллеров

(GRA-1-K-T), содержащего 1x10 клеток-киллеров/мл..

Пример 2. Лимфоциты из селезенки мьшш подвергают обработке культуральной средой RPM1-1640, содержащей 15% FCS, с целью доведения числа лимфоцитов до 5-10 на 1 мл. Затем к этим лимфоцитам добавляют

гликосвяЗанный антиген (GRA-M-I), со- Q GRA-5-K-T-2.

/

держащий 156 мкг белка и 94 мкг сахара, причем прибавление осуществляют таким образом, чтобы конечное количество белка и сахара составляло 1,5 мкг/мл и 0,.9 мкг/мл соответственно. 5-миллш1итровую порцию полученной смеси культивируют в лабораторной чашке для культивирования клеток (6015 мм) при 37 С в течение 2 дней. При этом наблюдается образование клонов (клонирование). Затем эту порцию культивируют в культуральной среде RPMI-1640, имеющей 15% FCS и содержащей 20% по объему препарата ,TCGF дополнительно в течение 7 дней до получения 50 мл раствора клеток- силлеров (GRA-M-I-K-T) , содержащего клеток-киллеров/мл.

Пример 3. Лимфоциты периферической крови (5 10) зд()рового донора инкубируют в среде RPMI-1640, содержащей 1 нг/мл (содержание белка) GRA-2 и 15% FCS при 37°С. На второй день к среде добавляют TCGF человека до тех пор, пока концентрация не достигнет 20%, и пр одолжают инкубирование еще в течение 2 дней для получения киллерных клеток (GRA-2-K/T).

Пример 4. Препараты киллерных клеток GRA-8-K-T, ,GRA-3-A-K-T и GRA-3-C-K-T получают таким же способом, как в примере 1 с использованием GRA-8, GRA-3-A и GRA-3-C соответ- :ственно (содержание белков) 1000 нг/мл.

15

20

25

30

35

40

Пример 6. Лимфоциты периферической крови человека (5-10) инкубируют в 5 мл RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-1,при в течение 2 дней. На третий день лимфоциты переносят в среду RPMI-1640, содержащую 10%- ную сыворотку от донора лимфоцитов и от О до 100 нг/мл (белковое содержание) GRA- 1 , и продолжают инкубирование еще в течение 5 дней для получения препаратов киллерных клеток.

Пример 7. Лимфоциты Периферической крови (PBL), взятые у различных раковых больных после операции, сенсибилизируют GRA-3 с получением препаратов киллерных клеток, PBL (5-10 ), взятые у больных, инкубируют в среде RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3, в течение 2 дней, а затем в среде RPMI-1640, содержащей 20% TCGF и 15% FCS, еще в течение 5 дней для получения киллерных клеток.

PBL (5)10 ), собранные у больных раком груди по прошествии 21 дня после операции, инкубируют в среде RPMI-16405 содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3 и 10%-н то сыворотку,, взятую у пациентов, в течение 7 дней для сенсибилизации PBL и получения препарата киллерных клеток (GRA-3-K-T-7).

Для выявления противораковой акПример 5. Мышам СЗН/Не (сайт jг тивности препарат GRA-M-I разбавляют

ка, 8 недель) пересаживают внутрикож- но клетки Х5563 (Ю) того же штамма, и по истечению 7 дней опухоль извлекают хирургическим путем. Еще через 7 дней прививают клетки Х5563 (10) того же штамма, и мьши, устойчивые к прививкам, названы иммунными мышами.

Клетки селезенки иммунных мьш1ей и нормальных мышей СЗН/Не получают с помощью обычного метода.

Каждую партию клеток селезенки (5 10 /лунку) сенсибилизируют 40 нг/мл (содержание белка) ..

50

55

физиологическим солевым раствором так, чтобы количество сахара и белка составляли соответственно 1,0 мкг/мл и 1,6 мкг/мл с целью получения противоракового агента.

Злокачественную опухоль, развившуюся у мьш1ки СЗН/Не в результате . спонтанно возникшего рака молочной железы, вырезают в стерильных условиях, разрезают на 5-мш1лиметровые кусочки кубической формы н трансплантируют (пересаживают) под кожу спины каждой из десяти подопытиььч мьшгек СЗН/Не той же линии, что н мьтшка-до14125964

в среде RPMI-1640, содержащей 15% FCS, в течение 5 дней для получения киллерньпс клеток.

с Препарат киллерных клеток, полученных из нормальных клеток селезенки, обозначается GRA-M-5-K-T-I, а препарат, полученный из клеток селезенки иммунных мышей, обозначается

5

0

5

0

5

0

Пример 6. Лимфоциты периферической крови человека (5-10) инкубируют в 5 мл RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-1,при в течение 2 дней. На третий день лимфоциты переносят в среду RPMI-1640, содержащую 10%- ную сыворотку от донора лимфоцитов и от О до 100 нг/мл (белковое содержание) GRA- 1 , и продолжают инкубирование еще в течение 5 дней для получения препаратов киллерных клеток.

Пример 7. Лимфоциты Периферической крови (PBL), взятые у различных раковых больных после операции, сенсибилизируют GRA-3 с получением препаратов киллерных клеток, PBL (5-10 ), взятые у больных, инкубируют в среде RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3, в течение 2 дней, а затем в среде RPMI-1640, содержащей 20% TCGF и 15% FCS, еще в течение 5 дней для получения киллерных клеток.

PBL (5)10 ), собранные у больных раком груди по прошествии 21 дня после операции, инкубируют в среде RPMI-16405 содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3 и 10%-н то сыворотку,, взятую у пациентов, в течение 7 дней для сенсибилизации PBL и получения препарата киллерных клеток (GRA-3-K-T-7).

Для выявления противораковой ак0

5

физиологическим солевым раствором так, чтобы количество сахара и белка составляли соответственно 1,0 мкг/мл и 1,6 мкг/мл с целью получения противоракового агента.

Злокачественную опухоль, развившуюся у мьш1ки СЗН/Не в результате . спонтанно возникшего рака молочной железы, вырезают в стерильных условиях, разрезают на 5-мш1лиметровые кусочки кубической формы н трансплантируют (пересаживают) под кожу спины каждой из десяти подопытиььч мьшгек СЗН/Не той же линии, что н мьтшка-донор (группу подопытных животных составляли самцы в возрасте 7 недель). Через 7 дней после трансплантации . констатируют приживление и разрастание (пролиферацию) опухоли у всех подопытных мышек. Каждой из пяти мы.- шек вводят затем подкожно противораковый аг ент. Введение препарата осуществляют в дозе 300 мкл в день с интервалами в два дня. Оставшихся пятерых мышек используют в качестве контрольных животных, не подвергшихся лечению. Спустя десять дней после первого введения препарата у всех животных вырезают опухоль (оперативным путем) и замеряют средний вес опухоли в каждой группе животных. Одновременно производят патогистоло- гическое исследование.

Данные свидетельствуют о том, что в результате лечения произошло уменьшение размеров опухоли на 86,3%.

Результаты патогистологического - исследования,

У мьшек контрольной группы тело опухоли приобрело форму птичьего гнезда, тип ткани был подобен медуллярному каналикулярному раку (раку спинно-мозгового канала), причем размножение опухолевых клеток наблюдалось по всей ткани. В группе мьш1ек, которым вводили противораковый агент раковые клетки вызывали разжижитель- ный некроз в местах, где образовалис раковые клетки. При этом,происходила кальцификация и фибрикация (образование волокон), оставляя лишь очень ограниченное количество раковых клеток. Таким образом, в этом эксперименте наблюдалось отчетливое противоопухолевое действие противоракового агента изобретения.

Препарат GRA-I-K-T (1 мкл) поместили на микропластинку и оставили при комнатной температуре на 15 мин. Затем туда добавили 4 мкл FCS и смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение 30 мин. Обработанные ферментом нейраминидазой красные кровяные клетки (эритроциты) овцы (SRBCN) довели до концентрации 1 х X 10 клеток/мл и добавили 5 мкл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,2), содержащего 0,85% NaCl, после чего пластинку подвергли процедуре разделения с помощью центрифугирования при скорости 600 об/мин в течение 5 мин. Затем пластинку перевернули

0

5

и непрореагировавши эритроциты SRBCN удалили. Для прокрашивания лимфоцитов систему обрабатывали раствором красителя Брилльянт Крезил Блю и затем исследовали степень развития положительной реакции розеткообразо- вания (розеткообразующей позитивности) . В результате было обнаружено, что по крайней мере 98% клеток проявляет розеткообразующую позитивность (Т-клетки).

Проявление специфической киллер- ной активности в отношении раковых клеток.

Использовали следующие пять клеточных штаммов, имеющих различные отношения позитивности GRA (GRA Ро- sitivivity ratios). Эти клеточные штаммы использовали в качестве мишеней раковых клеток человека. Раковые клетки-мишени: ВТ-1 (лимфома Буркитта) Dandi (лимфома Буркитта) КАТО-111 (рак желудка) ЖN-45 (рак желудка) MOLT (Т-клеточная лейкемия) На микррпластинку нанесли с помощью процедуры центрифугирования при- , скорости 800 об/мин в течение 5 мин слой из 5-10 на источник мишеневых , раковых клеток. Затем туда осторожно добавили 4-10 на источник клеток- киллеров GRA-1-К-Т полученных по примеру 1, и систему инкубировали в течение 1ч.

Киллерную.активность определяли в соответствии со степенью образования зон гемолиза (пятен или бляшек- -plaque-forraacion) и оценивали ее с помощью следующей системы оценок:

++ наблюдалась значительная киллер ная активность;

1 наблюдалась выраженная киллер- ная активность;

± наблюдалась слабо выраженная киллерная активность;

- киллерной активности не наблюдалось.

В контрольной группе были использованы несенсибилизированные лимфоциты периферической крови человека, которые получали тем же способом за исключением того, что в этом случае 5 не использовали GRA.

Данные показывают, что Т-клетки- киллеры, полученные по предлагаемому способу, обладают сильной GRA-cne0

5

0

5

0

цифической ингибирующей активностью в отношении раковых клеток.

Пример 8 (сравнительный). В качестве специфических антигенов для использования в предлагаемом способе вместо GRA были использованы сами раковые клетки (per se).

Лимфоциты, сенсибилизированные раковыми клетками, бьти получены аналогично примеру 1, с той только разницей, что вместо GRA были использованы раковые клетки ВТ-1, Dandi, КАТО-111 или MKN-45 в дозе ЫО клеток на лабораторную чгашку.

При использовании полученных таким образом лимфоцитов проводили исследование их цитотоксической актив- ности по той же методике. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Как видно из табл. .1, приготовленные лимфоциты не обладали какой-либо итотоксической активностью по отноению к раковым клеткам-мишеням.,

5

Специфическое высвобождение Сг

(Высвобождение при испытании) - ССамопроизвольное высвобождение) (Максимальное высвобождение) - (Самопроизвольное высвобождение)

Максимальное высвобождение обозначает радиоактивность, при которой все клетки лизированы.

При использойании в качестве мишени клеток КАТО-Щ, меченых Сг, наблюдалось специфическое высвобождение Сг, равное 14,3% (Е/Т 20/1)

Пример 9. Получение GRA.

Иммобилизованный лектин (PNA-Se- pharose) получают следующим образом, 3 г CNBr-активированной Сефарозы 4В тщательно промывают 1 мм раствором соляной кислоты и суспендируют в 200 $ш 0,1 М раствора бикарбоната натрия (рН 8,5). Затем к полученной суспензии прибавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 8,5), содержащего 20 мг арахисового лектина (PNA) и смесь оставляют реагировать в условиях периодического перемешивания при на период, равный 2ч, с целью получения иммобилизованного препарата лектина (PNA-Sepharose).

Аналогично, за исключением того, что вместо PNA использовали DBA (агглютинин бобов Долихас), получили DBA-Сефарозу.

Получение GRA.

Раковые клетки ВТ-1 (лимфомы Бур- китта, 1,3-10 клеток) промывают

0

0

Цитотоксичность каждого из препаратов киллерньгх клеток определяли с помощью теста на высвобождение Сг. А именно, 50juCi радиоактивного Сг (Японская Ассоциация Изотопов) добавляли к КАТО-111 (2-10) и клетки инкубировали при в течение 1 ч в среде RPMI-1640, промывали при центрифугирований с получением клеток мишеней, меченный Сг.К клеткам-мишеням (1 -10 ) добавляли киллерные клетки (эффекторные клетки, 2-10 ) таким образом, чтобы Е/Т 20/1, смесь инкубировали при 37 С в течение 4 ч в среде RPMI-1640. Супернатант собирали с помощью центрифугирования, определяли его радикальность в жидкостном счетчике-сцинцилляторе.

Специфическое высвобождение Сг (%), соответствующее цитолитической активности эффекторных клеток, вычисляли по следующей формуле:

0

5

0

5

0

5

3 раза физиологическим солевым раствором и прибавляют 30 мл 0,01 М буфера трис-соляная кислота (рН 7,4), содержащего 2% эмульгатора Тритоп Х-100 ; 0,85% NaCl, 2 мМ СаС и 2 мМ хлористого магния. Полученную смесь перемешивают при 4 с в течение 15 мин и затем подвергают ультрацентрифугированию при 100000 g. Из 28 мл полученной таким образом надосадоч- ной жидкости (супернатанта) 14-мидли- литровую порцию пропускают через колонку (диаметром 0,5 см и длиной

1см) для аффинной хроматографии, набитую сферическими гранулами иммобилизованного на агарозе лектина (PNA-Sepharose), которую уравновешивают трис-солянокислым буфером (рН7,4),- содержащим 0,1% Тритона Х-100, 0,85% NaCl, 2 мМ 2 мМ МаС. После промывки колонки тем же буфером ее элюируют 0,01 М трис-солянокислым буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М лактозы, 0,85% NaCl, 2 мМ CaCl,

2мМ MgCl и 0,1% Тритона Х-100. Элюированную таким образом порцию диализуют против 0,01 М трис-соляно- кислого буфера, содержащего 0,85% NaCl, 2 мМ CaClj, у 2 мМ MgCl , в течение 48 ч, в результате чего получа914

ют 17 мл раствора GRA, Количество белка и количество сахара (углеводов) в этом растворе GRA измеряют по мег тоду Фолина-Лоури (концентрация белка) и по методу, основанному на использовании системы фенолсерная кис.- лота (концентрация сахара). При этом было найдено, что в растворе GRA содержание белка составило 644 мкг, а содержание сахара - 120 мкг соответ- ственно. Этот препарат (раствор GRA) будет именоваться GRA-1.

Клетки рака молочной железы (ММТ) мьши СЗН/Не (1 ю клеток) промывают 3 раза физиологическим солевым раствором, после чего обрабатывают их 30 мл 0,01 М трис-солянокислого буфера (рН 7,4), содержащего 2% Тритона Х-100, 0,85% NaCl, 2 мМ CaClj и 2 мМ хлорида магния. Полученную смесь перемешивают при 4°С в течение 30 мини После этого смесь центрифугируют на ультрацентрифуге при 100000 g в течение 2 ч и полученный супернатант диа- лизуют в течение ночи против О,1 М трис-солянокислого буфера (рН 7,4)i содержащего 0,85% NaCl, 2 мМ CaCl и 2 мМ MgCl. Диализованную таким образом жидкость сконцентрируют до объема, равного 3 мл, и 1-миллилит- ровую порцию этого раствора пропускают через колонку (диаметром 0;5 и длиной 2 см) для аффинной хроматографии, заполненную-тем же иммобилизованным на Сефарозе лектином (PNA - Sepharose) , уравновешенную трис -соля- нокислым буфером (рН 7,4), содержащим 0,005% Тритона Х-100 0,85% NaCl, 2 мМ CaCl, и 2 мМ MgGl.. После тщательной промывки колонки тем же буфером ее элюировали 0,01 М трис-солянокислым буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М лактозы, 0,85% NaCl, 2 мМ CaClj,, 2 мМ MgCl и 0,005% Тритона Х-100, и полученный таким образом элюат диализуют в течение 48 ч против 0,01 М трис-солянокислого буфера (рН 7,4), содержащего 0,85% NaCl, 2 мМ СаС и 2 мМ MgClj,, в результате чего получают 2 мл раствора GRA. В полученном таким образом растворе GRA содержалось 156 мкг белка и 94 мкг сахара. Этот препарат будет именоваться GM-M-I.

Примерно 120 г (влажного веса) КАТО-111 гомогенизируют в 100 мл PBS с помощью размельчителя Варинга. После центрифугирования при 100000 g

259610

в течение 1 ч таблеуку растворяют в 100 мл 2%-ного Тритона Х-100 в 0,01 М буфере трис-НС1 (рН 7,6), соf. держащем 0,15 М MaCl. После центрифугирования при.100000 g в течение 1 ч собирают супернатант и наносят его на колонку PNA-Сефарозы 4В (0,8 х X 15 см), уравновешенную 0,015%-ным

0 Тритоном Х-100 в 0,01 М трис-НС1

(рН 7,6), содержащем 0,15 М NaCl. После промывания 50 мл буфера GRA элюи- руют буфером, содержащим 0,1 М лактозы. Элюированный GRA диализуют про15 тив 0,85% NaCl, концентрируют с помощью Сефадекс Pharmacia Со. и.хранят при -20 С до использования.

Обнаружили, что содержание белка и сахара, определенное таким же спо20 собом, составляло 2,0 мг и 0,8 мг соответственно. Этот препарат будет называться GRA-2.

Аналогично получали другие пробы GRA (табл. 2).

25 Аналогично, кроме того, использовали клеточную линию (MKN-45; около 29 г) вместо КАТО-Щ, вместо PNA- Сефарозы 4В использовали DBA-Сефаро- зУа проводили злюирование с помощькГ

30 N-ацетилгалактозамина, получали препарат GRA, содержание белка в котором составляло 0,03 мг, а содержание сахару составляло 0,01 мг. Это препарат GRA-8.-.

Локализация (местонахождение) GRA. Получение FITC-меченого лектина (PNA-FITC). 10 мг арахирового. лектина растворяют в 2 мл 0,01 М фосфатного буфера, содержащего 0,85% NaCl

4Q (рН 7,2). В 1 мл 0,5 М бикарбонатно- го буф.ера (рН 9,0) растворяют 2 мг FITC, О,5-миллилитровую порцию полученного раствора прибавляют к ранее приготовленному раствору арахисового .g лектина в фосфатном буфере. Далее эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего наносят на колонку с Сефадексом G-25. (стандартная колонка диаметром 10 мм и длиной 300 мм) и подвергают разделению собирая фракцию, соответствующую начальному пику. Отношение FITC/PNA 1,0.

Получение лектина, меченого FITC

35

50

55

(DBA-FITC) аналогично. DBA-FITC получали с использованием DBA. FITC/DBA 0,9.

Агглютинин соевых бобов - FITC (FITC-SBA) соотношение FITC/SBA 1,4.

1 I

Локализация GRA в различных раковых клетках.

Раковые клетки культуры ткани человека (1-10 ) промывают 3 раза 0,05 буферным раствором трис-соляная кислота, содержащим 0,85% хлорида натрия (рН 7,2), используя для этого прцедуру центрифугирования, после чего прибавляют к ним 100 мкл FITC-мечено го лектина (PNa-FITG, DBA-FITC или SBA-FITC 200 мкг/мл, приготовленного как описано.

Полученную смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 30 мин для протекания реакции. После Завершения реакции указанную реакционную смесь трижды промывают 0,01 М фосфатным буфером, содержащим 0,85% NaCl (рН 7,2), после чего промытые клетки помещают на стеклянную пластинку и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа.

Злокачественные ткани, взятые у раковых больных, пропускают через сетку из нержавеющей стали ( # 150) для получения суспензии единичньЕХ клеток. После двукратного промывания .буфером 0,01 М трис-HCI (рН 7,4), содержащим 2 мМ CaCl, 2 мМ MgClg ,и 0,85% NaCl 510 клеток, повторно суспендируют в 100 мл буфера. 100 мл FITC-PNA или FITC-SBA (200 мг/мл) добавляют к этой клеточной суспензии и смесь выдерживают при комнатной температуре 20. мин После трехкратного промьшания холодным PBS клетки наблюдают лод флуоресцентным микроскопом.

Таким образом, предлагаемый спосо позволяет повысить цитотоксическую активность лимфоцитов против раковых клетюк за счет использования GRA, полученного из компонентов раковых клеток, при этом активность лимфоцитов возрастает до 38% цитотоксичнос- ти и более.

ВТ-1

у Рак груди

QG-56

33

5 24

р

мула

12 и 3 о б р

е т е н и я

5

0

т л и ч а- качестве лек30

тина используют арахисовый лецитин и агглютинин из бобов Долихос.

Т а б л и ц а 1

Клетки- мищени

Раковые клетки, использовав- щиеся для сенсибилизации Лимфоцитов

ВТ-1 Dandi КАТО-11 1MKN-45

о

45

I

у

ВТ-1 Dandi КАТО-111 MKN-45

Таблица 2

0,9 0,5 0,38

Извлеченный хирургическим путем.