СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕКРЕТОРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА A ИЗ МОЛОЗИВА РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2006 года по МПК A61K35/12 A61K35/20 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения секреторного иммуноглобулина класса A (S-IgA), используемого для оценки иммунного статуса животного.

Известен способ получения S-IgA из сыворотки молозива животных (Иммунологические методы. Под ред. Х.Фримеля, Мир, 1979, с.280-284). Согласно известному способу сыворотку молозива обрабатывают двукратно сульфатом аммония, диализуют, затем проводят ступенчатое элюирование с ДЭАЭ-целлюлозы фосфатными буферами от 0,01 М рН 7,4 до 0,13 М рН 6,0, концентрируют, диализуют и проводят гель-фильтрацию на G-200 в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,8.

Недостатками известного способа являются низкий выход и качество целевого продукта, длительность и сложность получения иммуноглобулина А из молозива животных.

Задачей заявленного технического решения является повышение выхода и качества целевого продукта, а также ускорение способа.

Поставленная задача решается в способе получения секреторного иммуноглобулина А из молозива животных путем биохимической обработки биологической жидкости, отделением целевого продукта гель-фильтрацией с последующим замораживанием тем, что к сыворотке молозива последовательно добавляют сульфат цинка в конечной концентрации 19,3-35,4% с экспозицией 1-2 часа и этилендиаминтетрауксусную кислоту в конечной концентрации 0,8-1,0%, далее осадок отделяют центрифугированием с последующем диализом надосадочной жидкости в 0,015-0,02 М Трис-HCl буфером с рН 8,0-8,2, затем диализат подвергают гель-фильтрации на Sephacryl S-400 с 0,05-0,1 М Трис-HCl буфером с рН 8,0-8,2 и с 0,4-0,9 М хлористым натрием, отделяя 1-ю и 2-ю фракции белков под контролем иммуноэлектрофореза с использованием антисывороток к белкам животных, а целевой продукт получают концентрированном фракций белков.

Поставленная задача решается также в способе тем, что концентрированно фракций белков проводят в полиэтиленгликоле-40000 до содержания иммуноглобулина А в целевом продукте в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных в 1,5-2 раза.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения иммуноглобулина А аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию "новизны".

Все режимы способа осуществимы в лабораторных условиях направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение "промышленно применимо".

Впервые предложен способ получения иммуноглобулина А, в котором сыворотку молозива животных без последовательного осаждения сульфатом аммония или полиэтиленгликолем, непосредственно сразу обрабатывают 0,1 М раствором сернокислого цинка и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и отделяют целевой продукт из исследуемой биологической жидкости гель-фильтрацией при определенных режимах (в частности, только использование Sephacryl S-400 и добавление к Трис-HCl буферу хлористого натрия только в определенных концентрациях позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение выхода и качества целевого продукта). Кроме того, исключение ряда этапов в способе получения иммуноглобулина А из биологической жидкости животных при увеличении выхода и качества целевого продукта позволило существенно упростить и ускорить процесс его получения, т.е. предложение соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Получение S-IgA из молозива коров. К 20 мл сыворотки молозива коров добавляют по каплям 0,1 М раствор сернокислого цинка до конечной концентрации 27,35% и инкубируют 1,5 часа при комнатной температуре, затем центрифугируют при 1000 g 15 мин и добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до 0,9%. Диализ против 0,0175 М Трис-HCl буфера рН 8,1. Диализат в объеме 5 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 (диаметр бусинок 40-105 μm, область фракционирования от 20.000 до 8.000000 дальтон) на колонке размером 16×1000 мм. В качестве элюента используют 0,075 М Трис-HCl буфер, рН 8,1 с 0,65 М NaCl. Скорость элюирования составляет 10 мл/час.Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 5 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки в первых двух фракциях, содержит иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая IgA), что подтверждается иммуноэлектрофоретическим анализом (ИЭФ) белковых фракций. Концентририруют в ПЭГ (40.000) до содержания 9,36 мг/мл, что в 2 раза больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных. Целевой продукт замораживают при -20°С. Время получения S-IgA составляет 24 часа. В то же время известным способом время получения S-IgA из молозива коров составляет 5 суток (в 5 раз медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного IgA составляет 3,8 мг/мл (т.е. на 60% меньше).

Пример 2. Получение S-IgA из молозива коров. К 30 мл сыворотки молозива добавляют по каплям 0,1 М раствор сернокислого цинка до конечной концентрации 19,3% и инкубируют 1,0 час при комнатной температуре, затем центрифугируют при 1000 g 30 мин и добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до 0,8%. Диализ против 0,015 М Трис-HCl буфера, рН 8,0. Диализат в объеме 6 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 (диаметр бусинок 40-105 μm, область фракционирования от 20.000 до 8.000000 дальтон) на колонке размером 16×1000 мм. В качестве элюента используют 0,05 М Трис-HCl, буфер рН 8,0 с 0,4 М NaCl. Скорость элюирования составляет 12 мл/час. Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 6 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки в 1-ой и 2-ой фракциях, содержит иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая IgA), что подтверждается иммуноэлектрофоретическим анализом (ИЭФ) белковых фракций. Концентрируют в ПЭГ (40.000) до содержания 10,5 мг/мл, что в 2 раза больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных. Целевой продукт замораживают при -20°С. Время получения S-IgA составляет 24 часа. В то же время известным способом время получения S-IgA из молозива коров составляет 5 суток (в 5 раз медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного IgA составляет 4,2 мг/мл (т.е. на 60% меньше).

Пример 3. Получение S-IgA из молозива овец. К 10 мл сыворотки молозива овец добавляют по каплям 0,1 М раствор сернокислого цинка до конечной концентрации 35,4% и инкубируют 2 часа при комнатной температуре, затем центрифугируют при 900 g 15 мин и добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до 1%. Диализ против 0,02 М Трис-HCl буфера, рН 8,2 на магнитной мешалке. Диализат в объеме 4 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 (диаметр бусинок 40-105 μm, область фракционирования от 20.000 до 8.000000 дальтон) на колонке размером 16×1000 мм. В качестве элюента использовали 0,1 М Трис-HCl, буфер рН 8,2 с 0,9 М NaCl. Скорость элюирования составляет 10 мл/час. Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 5 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки в первых двух фракциях, содержит иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая IgA), что подтверждается иммуноэлектрофоретическим анализом (ИЭФ) белковых фракций. Концентрируют в ПЭГ (40.000) до содержания 6,3 мг/мл, что в 1,5 раза больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных. Целевой продукт замораживают при -20°С. Время получения S-IgA составляет 24 часа. В то же время известным способом время получения S-IgA из молозива коров составляет 5 суток (в 5 раз медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного IgA составляет 3,8 мг/мл (т.е. на 40% меньше).

Пример 4. Получение S-IgA из молозива коз. К 15 мл сыворотки молозива коз добавляют по каплям 0,1 М раствор сернокислого цинка до конечной концентрации 27,35% и инкубируют 1,5 часа при комнатной температуре, затем центрифугируют при 1000 g 30 мин и добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до 0,9%. Диализ против 0,0175 М Трис-HCl буфера, рН 8. Диализат в объеме 6 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 (диаметр бусинок 40-105 μm, область фракционирования от 20.000 до 8.000000 дальтон) на колонке размером 16×1000 мм. В качестве элюента используют 0,075 М Трис-HCl буфер, рН 8,1 с 0,65 М NaCl. Скорость элюирования составляет 12 мл/час.Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 5 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки в 1-ой и 2-ой фракциях, содержит иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая IgA), что подтверждается иммуноэлектрофоретическим анализом (ИЭФ) белковых фракций. Концентрируют в ПЭГ (40.000) до содержания 8,5 мг/мл, что в 1,5 раза больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных. Целевой продукт замораживают при -20°С. Время получения S-IgA составляет 24 часа. В то же время известным способом время получения S-IgA из молозива коров составляет 5 суток (в 5 раз медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного IgA составляет 2,5 мг/мл (т.е. на 70% меньше).

Пример 5. Получение S-IgA из молозива коров. К 50 мл сыворотки молозива КРС добавляют по каплям 0,1 М раствор сернокислого цинка до конечной концентрации 19,3% и инкубируют 1,0 час при комнатной температуре, затем центрифугируют при 1000 g 15 мин и добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до 0,8%. Диализ против 0,015 М Трис-HCl буфера, рН 8,0. Диализат в объеме 6 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 (диаметр бусинок 40-105 μm, область фракционирования от 20.000 до 8.000000 дальтон) на колонке размером 16×1000 мм. В качестве элюента использовали 0,05 М Трис-HCl буфер, рН 8,0 с 0,4 М NaCl. Скорость элюирования составляет 12 мл/час. Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 6 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки в первых двух фракциях, содержит иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая IgA), что подтверждается иммуноэлектрофоретическим анализом (ИЭФ) белковых фракций. Концентрируют в ПЭГ (40.000) до содержания 10,0 мг/мл, что в 2 раза больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных. Целевой продукт замораживают при -20°С. Время получения S-IgA составляет 24 часа. В то же время известным способом время получения S-IgA из молозива коров составляет 5 суток (в 5 раз медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного IgA составляет 4,2 мг/мл (т.е. на 60% меньше).

Пример 6. Получение S-IgA из молозива коз. К 10 мл сыворотки молозива коз добавляют по каплям 0,1 М раствор сернокислого цинка до конечной концентрации 35,4%, и инкубируют 2 часа при комнатной температуре, затем центрифугируют при 1000 g 15 мин и добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до 1%. Диализ против 0,02 М Трис-HCl буфера, рН 8,2. Диализат в объеме 4 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 (диаметр бусинок 40-105 μm, область фракционирования от 20.000 до 8.000000 дальтон) на колонке размером 16×1000 мм. В качестве элюента используют 0,1 М Трис-HCl буфер, рН 8,2 с 0,9 М NaCl. Скорость элюирования составляет 12 мл/час.Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 5 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки в 1-ой и 2-ой фракциях, содержит иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая IgA), что подтверждается иммуноэлектрофоретическим анализом (ИЭФ) белковых фракций. Концентририруют в ПЭГ (40.000) до содержания 8,0 мг/мл, что в 1,5 раза больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных. Целевой продукт замораживают при -20°С. Время получения S-IgA составляет 24 часа. В то же время известным способом время получения S-IgA из молозива коров составляет 5 суток (в 5 раз медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного IgA составляет 2,2 мг/мл (т.е. на 70% меньше).

Как показали результаты экспериментальных исследований, согласно примерам 1-6 предлагаемый способ позволяет на 40,0 - 70,0% повысить выход целевого продукта с сохранением его биологической активности, а также ускорить в 5 раз процесс получения S-IgA.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу получения секреторного иммуноглобулина A (S-IgA) из молозива животных. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива животных путем последовательного добавления к сыворотке молозива при определенных условиях сульфат цинка и этилендиаминтетрауксусную кислоту, далее осадок отделяют центрифугированием с последующим диализом надосадочной жидкости, затем диализат подвергают гель-фильтрации при определенных условиях, отделяя 1-ю и 2-ю фракции белков под контролем иммуноэлектрофореза с использованием антисывороток к белкам животных, а целевой продукт получают концентрированием фракций белков с последующим замораживанием. Способ позволяет повысить выход и качество целевого продукта и ускорить процесс получения целевого продукта. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива животных путем биохимической обработки биологической жидкости, отделением целевого продукта диализом и гель-фильтрацией, отличающийся тем, что к сыворотке молозива последовательно добавляют сульфат цинка в конечной концентрации 19,3-35,4% с экспозицией 1-2 ч и этилендиаминтетрауксусную кислоту в конечной концентрации 0,8-1,0%, далее осадок отделяют центрифугированием, затем подвергают гель-фильтрации на Sephacryl S-400 с 0,05-0,1 М Трис-HCL буфером с рН 8,0-8,2 и с 0,4-0,9 М хлористым натрием, отделяя 1-ю и 2-ю фракции белков под контролем иммуноэлектрофореза с использованием антисывороток к белкам животных, а целевой продукт получают концентрированием фракций белков с последующим замораживанием.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование фракций белков проводят в полиэтиленгликоле-40000 до содержания иммуноглобулина А в целевом продукте в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных в 1,5-2 раза.