Способ получения щелочной фосфатазы Советский патент 1990 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/19 

I

Изобретение относится к технической микробиологии, касается получения фермента щелочной фосфатазы Escherichia coli и может быть использовано в генной инженерии, молекулярной биологии и иммуноферментном анализе.

Целью изобретения является повышение степени очистки целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки Escherichia coli ВКПМ В-629 (С4) разрушает термошоком при 82i2°C 15 мин, отделяют бесклеточный экстракт центрифугированием, фракционируют сульфатом аммония, обессоливают и хроматографиругот на колонке с ДЭАЭ- целлюлозой ДЭ-52. Затем фермент обессоливают диализом и хроматографируют на колонке с CL-сефарозой 6В, связанной с лигандом-красителем краснр-ко- ричневьгм 2 К в концентрации 1,2-2,5 мкм красителя/мл сефарозы в 0,005-0,05 М трис-HCl буфере рН 7,0-8,0, содержащем 0,005 М ZnCli. В результате получают практически гомогенный препарат (чистота 98,4%), свободный от нуклеазных примесей.

Пример 1. Получение аффинного сорбента.

К 180 мл CL-сефарозы 6В прибавляют 40 мл воды, нагревают до 60 С и при перемешивании механической мешалкой прибавляют небольшими порциями 478мг красно-коричневого красителя 2К, растворенного в 20 мл воды. После перемешивания в течение 30 мин прибавляют 24 г NaCl и перемешивают при 60°С еще 1 ч. Смесь нагревают до 80°С, прибавляют 2,1 г NaaC03, перемешива.ел j

о ел

СЭ

со

ют 2 ч филътруют и отмывают холодной и горячей (80°С) водой до получения бесцветного фильтрата. Получают сорбент, содержащий 1,4 мкм красителя красно-коричневого 2К/мл сефарозы 6В.

Выделение и очистка щелочной фос- фатазы.

Получение ферментного экстракта.

500 г замороженной биомассы клеток Е. coli ВКПМ В-629 размельчают скальпелем и заливают 2,5 л 0,01 М трис- HCl буфером рН 7,5, содержащем 0,01 М MgCl 1, и помещают в ледяную баню. Содержимое стакана перемешивают до полу- чения гомогенной суспензии. Суспензию биомассы ставили в кипящую баню, постепенно в биомассу заливали 2,5 л кипящего 0,01 М трис-HCl буфера, рН 7,5, содержащего 0,01 MgCl7, с целью доведе ния температуры клеточной суспензии до 8212°С. Термошок проводят при этой температуре 15 мин.

После проведения термошока экст- ракт охлаждают до 412 С, центрифугируют при 10000 g 1 ч и супернатант используют для выделения фермента.

Концентрирование и фракционирование ферментного экстракта сульфатом аммония.

4 л насадочной жидкости концентрируют ультрафильтрацией кассетным прибором Pellicon до 500 мл. К концентрату при постоянном перемешивании добавляют сухой сульфат аммония до 60% насыщения. Осадок отделяют и отбрасывают, а к супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 85% насыщения. Осадок собирают центрифугированием, растворяют в 150 мл 0,01 М трис-НС буфера, рН 8,0, содержащего 0,001 М MgClt, и диализируют в течение 18 ч против 10 л указанного буфера. Получают 180 мл диализата.

Хроматография щелочной фосфатазы Е. coli на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой ДЭ-52.

Диализат фермента (180 мл) подвергают хроматографии на колонке (5 25 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравнове- шенной диализным буфером, После нанесения ферментного раствора, колонку промывают 1,5 л исходного буфера, а затем линейным градиентом (Зл) NaCl от 0 до 0,5 М в исходном буфере, соби рая фракции по 10 мл. Щелочная фос- фатаза элюируется в пределах 0,1- М NaCl. Объединенные активные

)

0 5

0

5

фракции (150 мл) осаждают сульфатом аммония до 80%-ного насыщения. После центрифугирования (22000 g, l5MHH)| осадок растворяют в 40 мл 0,01 М трис-HCl буфера, рН 7,5, содержащего 0,001 М ZnCl, и диализуют 18 ч против 2 л того же буфера. Получают 50 мл диализата.

Хроматография фермента на колонке с красителем.

Диализат щелочной фосфатазы (50мл) подвергают хроматографии на колонке (2,5«15 см) с CL-сефарозой 6В красно- коричневый краситель 2К, содержащей 1,4 мкм красителя/мл сефарозы, уравновешенной диализным буфером. При этом фосфатаза не сорбируется и выходит острым пиком, а нуклеазные примеси сорбируются и могут быть элю- ированы при повышении ионной силы до 1 М КС1.- Фракции щелочной фосфатазы объединяют и концентрируют.

I

Концентрирование конечного препарата.

Объединенные фракции диализуют против 1 л 0,01 М трис-HCl буфера рН 7,5, содержащего 0,001 М MgCl г, 0,05 М NaCl и 50% глицерина (по объему). Диализ продолжают в течение 12ч. Препарат помещают в предварительно охлажденную емкость и хранят при -20 С. Выход щелочной фосфатазы Е. coli составляет 33% с удельной активностью 30 ед/мг белка. Ферментный препарат не содержит нуклеазных примесей и пригоден для использования в генноин- женерных экспериментах и молекулярной биологии. Активность щелочной фосфатазы Е. coli определяют по гидролизу 4- нитрофенил фосфата. За единицу активности принимают то количество фермента, которое гидролизует 1 мкм 4-нит- рофенилфосфата за 1 мин при 25°С. В полученном препарате отсутствуют дезоксинуклеазные, дезоксиэкзонукле- азные и рибонуклеазные примеси.

П р и м е р 2. Способ получения щелочной фосфатазы Е. coli аналогичен примеру 1, однако при хроматографии на колонке с красителем используют сорбент, содержащий 1,2 мкм красителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит 0,005 М трис-HCl, рН 7,0 и 0,0005 М ZnCl-г.

П р и м е р 3. Способ получения щелочной фосфатазы Е. coli аналогичен примеру 1, однако при хроматографии

на колонке с красителем используют сорбент, содержащий 2,5 мкм красителя/мл сефарбзы, а исходный буфер содержит 0,05 М трис-HCl, рН 8,0, и 0,005 М ZnClj.

Приме р 4. Способ получения щелочной фосфатазы Е. coli аналогиче призеру 1, однако при хроматографии на колонке с красителем используют сорбент,содержащий 3 мкм красителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит 0, 1 М трис-HCl, рН 8,5, и 0,01 М ZnCli. Полученный препарат содержи дезоксиэндонуклеазные и рибонуклеаз- ные примеси.

Приме р 5. Способ получения щелочной фосфатазы Е. coli осуществлют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонке с красителем используют сорбент, содержащий 1 мкм/мл сефарозы и исходный буфер содержит 0,001 М трис-HCl рН 6,5 и

0,00001 М ZnCl. Полученный препарат содержит дезоксиэндонуклеазные и ри бонуклеазные примеси.

Формула изобретения

Способ получения щелочной фосфатазы предусматривающий разрушение клеток Escherichia coli температурным

шоком, фракционирование сульфатом аммония с последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, отличаю- . щ и и с я тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта,

используют клетки штамма Escherichia coli ВКПМ В-629, а после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе проводят хроматографию на CL-сефарозе с иммобилизованным красителем красно- коричне0 вым 2К в концентрации 1,2-2,5 мкм красителя/мл геля в 0,005-0,05 М трис-HCl буфере с рН 7,0-8,0, содержащим 0,0005-0,005 М 2пС1г.

Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к способам получения щелочной фосфатазы из ESCHERICHIA COLI, которая находит применение в геноинженерных экспериментах и молекулярной биологии. С целью повышения степени очистки целевого продукта в способе проводят разрушение клеток из штамма E.COLI ВКПМ В-629 (C 4) термошоком, отделение бесклеточного экстракта центрифугированием, фракционирование сульфатом аммония, обессоливание и хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. В дальнейшем фермент обессоливается диализом и проводится хроматография на колонке с CL-сефарозой 6В, связанной с лигандом-красителем красно-коричневым 2К.