Способ получения макроглобулина Советский патент 1982 года по МПК A61K35/16 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения препарата макроглобулина, используемого в диагностических целях и иммуннохимических тестах.

Известен способ получения макроглобулина путем изобретательного высаливания сыворотки крови, диализа концентрата, гель-фильтрации диализата с последующей ионообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевого продукта

Однако макроглобулин, полученный известным способом, не облагает способностью подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител при иммунизации животных и реагировать с антителами в иммуннотоксических реакциях.

Цель изобретения - придание макроглобулину свойств подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител прИ иммунизации ЖИВО.ТНЫХ и реагировать с антителами в иммунохимических реакциях.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения макроглобулина путем избирательного -высаливания сыворотки крови, диализа крнцентрата, гель-фильтрации диализата с последующей ионообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевого продукта, сыворотку крови больных острым вирусным гепатитом избирательно высаливают сульфатом аммония .С концентрацией 40-44%, гель-фильтрации подвергают диализируемый экстракт на геле типа сефа10декс G-200, выделяют фракцию с параметрами элюции Kg-С,1-0,2, полученную фракцию концентрируют и диализ уют против 0,005-0,01 М фосфатного буфера при рН 6,5-6,8, да15лее диализат центрифугируют, полученный супернатант подвергают ионообменной и аффинной хроматографии и элюат стабилизируют аминометилольным производным формальдегида и

20 Е-лейцина.

Пример . Способ получения печеночного макроглобулина.

В качестве источника для получения печеночного макг-оглобулина (ПМ) пред25почтительно использовать сыворотку больного острым виpycны тепатитом в период наибольшей активности воспалительного процесса в печени.

К смеси сывороток при активном30перемешивании вносится насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 44%. Осадок формируется в те чение 16-18 ч при 4 С. Выпавший белок отделяется центрифугированием при 6-8 тыс об/мин в течение 30 мин Полученный осадок растворяется на магнитной мешалке в дистиллированно воде в объеме, составляющем 1/10 часть от.исходного. Если растворени осадка не производится, то он устой чив к хранению при с сохранение активности ПМ в течение 2-3 месяцев (срок наблюдения). Подготовленный раствор белка диа лизируётся против 0,15 М.раствора хлористого натрия ,2 в течение 24-48 ч при 4°С. Диализованный экст ракт подвергается гель-фильтрации через сефадекс G-200 или ультрагель АсА 34. Используется колонка размером 3,0-100,0 см, предварительно заполненная гелем и эквилибрированн 0,15 М раствором хлористого натрия ,2. Гель-фильтрация направлена на получение первого макроглобулярного пика, выходящего в свободном объеме геля. Фракции объединяют и концентрируют активным диализом или инфильтрацией. По окончании предыдущего этапа препарат наносится на колонку, заполненную сефарозой 6В или ультрагелем АсА 22 и эквилибрированную 0,15 М раствором хлористого натрия ,2. Эта хроматография направлена на получение активных .фракций, содержащих печеночный макроглобулин, т.е.способных тормозить миграцию лейкоцитов в гемокультуре При использовании сефарозы 6В или ультрагеля АсА 22 печеночный макроглобулин выявляется во фракциях непосредственно следующих за первым белковым пиком в свободном объеме геля. Активные фракции объединяются концентрируютсяи диализуются против 0,005 М фосфатного буфера ,5 в .течение 24 ч при 4С. Выпавшие хлопья белка в процессе диализа удаляются центрифугированием при 6-8 тыс.об/мин в течение 30 мин. На подготовленный ДЭАЕ сефадекс А-50, уравновешенный 0,005 М фосфат ным буфером ,5, наносится диализованный препарат почечного макро глобулина. Не прореагировавший с ионообменником белок элюируется 0,005 М фосфатным буфером ,5. Скорость протекания элюирующего раствора через колонку 10-20 мл в час. Соотношение анионит.: белок 5:1. Элюирование веществ с ионообменника проводится линейным градиентом хлористого натрия от 0,01 до 1,0 М в фосфатном буфере ,5. Активные фракции, элюированные 0,2-0,4 М хпористого натрия, объединяются, концентрируются и диализуются против 0,1 М трис-нсе буфера, рН 7,2. На подготовленную колонку, заполненную сефарозой и коньюгированную специфическими антителами к печеночному макроглобину, наносится Диализованный препарат ПМ. Скорость протекания 1-2 мл в час. По окончании движения всего раствора через колонку она промывается 0,1 М трис HCt буфером, ,2 до нулевых показаний поглощения света при Элюирование печеночного макроглобулина с колонки осуществляется 0,2 М глицин-НСе буфером, ,2. По мере получения раствора белка величина рН раствора доводится до 7,2. Выделенный белок концентрируют и диализуют против 0,15 М раствора хлористого нат-рия. Учитывая, .что выделение печеночного макроглобулина производится из потенциально инфицированного сырья сыворотки крови человека, больного острым вирусным гепатитом, конечный препарат обрабатывается формальдегидом в присутствии Е-лейцина. Этот прием позволяет сохранить антигенную активность ПМ, снизить инфекционность и достичь стабильности препарата. К раствору белка печеночного макроглобулина в соотнсяаении 1:1 добавляется 0,132 М Е-лейцина и 0,0066 М формальдегида. Полученная смесь выдерживается при 32-37 С в течение 72 ч, после чего препарат может храниться при в течение одного года (срок наблюдения) без изменения антигенной активности и сохранением стерильности раствора. В случае ргщиоактивной метки ПМ используется формальдегид, радиоактивный по . Для удаления не прореагировавшего аминометилольного соединения препарат подвергается гельФильтрации через сельфадекс G-50. В таблице приведены характеристики печеночного макроглобулина.

Свойства

Физико-химические: молекулярная масса изоэлектрическая точка электрофоретическая подвижность в агаре и агарозе

Иммунохимическиё:

окрашивание линий преципитации

на белок

на гликопротеиды

на липопротеиды

реакция иммунологической неидетичности

реакция иммунологической неидентичности с. нормальными белками крови человека

иологические:

локализация и место образования обнаружение в экстрактах тканей плодов и взрослых выведение из организма

. влияние на миграцию лейкоцитов

влияние на прижизненную проницаемость

мембраны лимфоцитов человека для хлортетрациклина

влияние на процессы дыхания печеночных митохондрий крысы

линическая-характеристика:

наибольшая частота встречаемости

длительность выявления у больных острым вирусным гепатитом (А и В) обнаружение среди здоройого населения

Характер реакции

600.0001:200.000 дальтон рН 4,,3 Аналогично а -глобулину

Окрашивание Окрашивание Окрашивания нет ар-протеин, НВ -антиген тканевой в -глобулин, трофобластический фактор

Преальбумин, альбумин, фибриноген, тромбин, перулоплазмин, трансферин, а-в липопротеины, а-в гликопротеины, а-в макроглобулины, иммуноглобулины А, М, G, D, Е

Печень, гепатоцит

Не обнаружен Обнаружен в макрофагах дермального слоя кожи

Тормозит миграцию Нарушает проницаемость .

Ингибирует дыхание

Больные с гепатотропными заболеваниями . От 2 до 20 дня от начала клинических проявлений заболевания Не обнаружен

Предлагаемым способом выделяют белковую фракцию более 200000дальтон.

Полученная белковая фракция обладает способностью тормоз; ть миграцию лейкоцитов в гемокультурах. При иммунизации животных этим фактором удается получить антисыворотку, которую используют, и иммунологических

и серологических реакциях для диагностики порс1жений печени.

60

Формула изобретения

Способ получения макроглобулина путем избирательного высаливания сыворотки крови, диализа концентрата. гель-фильтрации диализата с послед пощей ионоообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевого продукта, отличающий.с я тем, что, с целью придания макроглоб лину свойств подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител при иммунизации животных и реагировать с антителами в иммунохимических реакциях, сыворот ку крови больных острым вирусным гепатитом избирательно высаливают 4044% -ным сульфатом аммония, гельфильтрации подвергают диализируемый экстракт на геле типа сефадекс G-200, выделяют фракцию с параметрами элюции KQ-0,1-0,2, полученную фракцию концентрируют и диализуют против 0,005-0,01 М фосфатного буфера при рН 6,5-6,8, далее диализат центрифугируют, полученный супернатант подвергают ионообменной и аффинной хроматографии и злюат стабилизуют аминометилольным производным формальдегида и Е-лейцина. Источники информации, ринятые во внимание цри экспертизе 1. Фримель X. Иммоннологические етоды. Mi, Мир, 1979.