СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕТИНАЛЬНОГО S-АНТИГЕНА Российский патент 2007 года по МПК A61K35/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения раствора ретинального S-антигена, являющегося важнейшим из всех ретинальных белков, дающий аутоиммунный ответ на увеоретиниты различной этиологии и входящий в патогенезис аутоиммунных ретинальных васкулитов человека. Используется в качестве маркера для диагностики офтальмологических заболеваний.

Ретинальный S-антиген представляет собой водорастворимый протеин с небольшим содержанием липидов с молекулярной массой около 50 кДа. S-антиген продуцируется клетками фоторецепторов ретины. Сырьем для получения S-антигена служит сетчатка глаза крупного рогатого скота (КРС). Получаемый материал может храниться от 8-48 часов при температуре 4°С, а при дальнейшем хранении должен быть заморожен при температуре минус 30°С.

Получение чистого S-антигена, пригодного для применения в ИФА, отличается трудоемкостью и многоэтапностью, что обусловливает поиск оптимального метода его выделения и очистки. Несмотря на то что определение уровня аутоантител к ретинальному S-антигену у офтальмологических больных и оценка угрозы возникновения офтальмопатологии до клинических ее проявлений является актуальной проблемой, существующие немногочисленные методы не обеспечивают достаточное качество и количество S-антигена и в большинстве своем являются невоспроизводимыми [1-4].

Ретинальный S-антиген получают из сетчатки глаза КРС.

Разработан способ получения S-антигена [1], включающий экстракцию 0,05 М трис-соляная кислота буферным раствором, рН 7,6, осаждение кристалличесим сульфатом аммония до конечной концентрации 35%, центрифугирование при 5000 g в течение 30 минут. Полученный осадок отбрасывают и к супернатанту вновь добавляют аммония сульфат до 70% насыщения. Полученный осадок растворяют в трис-соляная кислота буферном растворе рН 7,6. Затем проводят адсорбционную гидрофобную хроматографию на Phenil-sepharose и для доочистки используют метод гель-фильтрации на Ultragel AcA44.

Данный метод является практически невоспроизводимым.

Существует способ получения S-антигена [2], включающий измельчение исходного материала, экстракцию, центрифугирование (48000 g, 10 мин), осаждение двустадийное сульфатом аммония, центрифугирование (48000 g, 10 мин), гельфильтрацию (Ultragel AcA 34 или Sephadex G-200), адсорбционную хроматографию на HA-Ultragel.

Недостатками способа являются технологическая сложность и недостаточная чистота целевого продукта.

Описан способ получения ретинального S-антигена [3], включающий измельчение, экстракцию калий-фосфатным буфером, центрифугирование (80000 g в течение 60 минут), осаждение сульфатом аммония (насыщение до 40%), центрифугирование (1200 g, 30 мин), диализ против калий-фосфатного буферного раствора, ультрацентрифугирование (80000 g, 1 час), гель-фильтрацию на Sephadex G-150 и двойную ионно-обменную хроматографию на Biogel A.

Известен способ получения ретинального S-антигена [4], включающий гомогенизацию, экстракцию фосфатным буфером, центрифугирование (30000 g в течение 60 минут), осаждение сульфатом аммония, центрифугирование (30000 g, 30 мин), диализ против физиологического раствора (трижды, с заменой раствора на фосфатный буфер в последней порции), ультрацентрифугирование (80000 g, 1 час), гель-фильтрацию на Sephadex G-150, ионно-обменную хроматографию на DEAE Biogel А (дважды).

Был предложен также метод [5] получения ретинального S-антигена, включающий измельчение, экстракцию натрий-калий фосфатным буферным раствором, центрифугирование (48000 g, 20 минут), осаждение сульфатом аммония (до 40% насыщения), центрифугирование (4000 g, 15 мин), ультрацентрифугирование (100000 g, 1 час), гельфильтрацию на Ultragel АсА 34 или АсА 54 и гидрофобную хроматографию на Phenyl-Sepharose.

Недостатками данного метода являются технологическая сложность (например, необходимость использования высокоскоростных центрифуг) и недостаточная разделяющая способность гелей, используемых на хроматографических стадиях.

Ближайшим аналогом является способ получения ретинального S-антигена [6]: размороженную сетчатку глаз КРС измельчают, экстрагируют 0,05 М ледяным трис-соляная кислота буферным раствором рН 7,6. Эта и все последующие стадии осуществляются при температуре 4°С и в качестве рабочего раствора применяется 0,05 М трис-соляная кислота буфер. Экстракт центрифугируют при 20000 g в течение 20 минут. Полученный супернатант подвергают двустадийному осаждению в условиях 50% насыщения насыщенным раствором сульфата аммония рН 7,2. После центрифугирования осадок растворяют в минимальном количестве рабочего раствора и диализуют. Затем проводят гельфильтрацию на Ultragel AcA 44 и ионообменную хроматографию на DEAE-Sephadex A-50 для доочистки целевого продукта.

Недостатками прототипа являются низкий выход (0,8% от содержания S-антигена в экстракте) и недостаточная чистота целевого продукта, длительность и высокая трудоемкость процесса выделения.

Техническим результатом изобретения является увеличение выхода S-антигена, сокращение времени и достижение необходимой чистоты.

Способ получения ретинального S-антигена из сетчатки глаз КРС путем измельчения, экстрагирования, центрифугирования, осаждения, хроматографии, отличается тем, что осаждение проводят в три этапа насыщенным раствором сульфата аммония рН 7,2, первый этап которого осуществляют насыщением экстракта раствором сульфата аммония рН 7,2 до 20% по массе, для выделения S-антигена используют Sephacryl S-200 Superfine, а проведение хроматографической очистки методом гельфильтрации на Sephacryl S-200 Superfine осуществляют на колонке 25×100 со скоростью 1,2 мл/мин в буферном растворе трис-соляная кислота рН 7,6.

Способ осуществляют следующим образом.

Сетчатку глаз КРС размораживают при температуре 2-6°С, измельчают и экстрагируют в 0,05 М трис-соляная кислота буферный раствор, содержащий 0,04% азида натрия. Экстракцию проводят дважды: в первом случае на один грамм сетчатки используют 3 мл буфера, во втором - 1 мл. Эта и все последующие стадии осуществляются при температуре 4°С и в качестве рабочего раствора применяется 0,05 М трис-соляная кислота буфер pH 7,6, содержащий 0,04% азида натрия. Затем суспензию центрифугируют (6000-16000 об/мин) в течение 30 минут. Супернатанты собирают и объединяют. Полученный раствор подвергают осаждению насыщенным раствором сульфата аммония рН 7,2 в три стадии: 1) супернатант насыщается раствором сульфата аммония до 20% по массе. Отцентрифугированный осадок отбрасывается; 2) супернатант с предыдущей стадии насыщается до 50% насыщения, суспензия центрифугируется; 3) осадок собирается и растворяется в минимальном количестве рабочего буферного раствора и затем вновь насыщается до 50% насыщенным раствором сульфата аммония. После отделения осадок растворяют в минимальном объеме рабочего буферного раствора, фильтруют и наносят на колонку с гелем Sephacryl S 200.

Фракции, содержащие S-антиген, собирают.

Концентрирование фракций до необходимого объема проводят по содержанию общего белка 0,3-2,0 мг/мл на концентрирующей ячейке типа «Amicon» через мембраны с размером пор 10 кД.

Концентрат подвергают диализу против натрий-фосфатного буферного раствора рН 7,25.

После выполнения описанного процесса определяют электрофоретическую чистоту белка S-антигена и проводят количественное и качественное определение S-антигена (метод определения общего белка по Бредфорд и иммунотурбидиметрия).

Чистота полученного S-антигена должна быть не менее 75%.

При содержании примесных белков более 25% полученный препарат S-антигена очищают путем ионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose CL-6B.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются трехстадийное осаждение раствором сульфата аммония насыщенным рН 7,2 для уменьшения количества контаминирующих белков, использование геля Sephacryl S200 как сорбента с лучшей разделяющей способностью. В результате использования предлагаемого метода для получения S-антигена чистота и выход целевого продукта превышают приведенные в прототипе; кроме того, предлагаемый метод более доступен в аппаратурном исполнении и технологически более прост.

Пример конкретного исполнения

I. Подготовка экстракта:

Размораживают 25 г сетчатки в холодильнике при температуре 2-6°С в течение 24 часов, измельчают и помещают в раствор трис-соляная кислота рН 7,6 с добавлением 0,04% азида натрия в соотношении на 1 г материала 3 мл раствора. Суспензию оставляют на 12 часов. К осадку добавляется рабочий буферный раствор в количестве на 1 г - 1 мл. Суспензию оставляют на 12 часов, затем вновь следует центрифугирование при 6500 об/мин в течение 40 мин, декантация. Осадок отбрасывается. Супернатант собирают с обеих частей и объединяют. Таким образом, получают 100 г экстракта, содержащего S-антиген.

II. Осаждение

Осаждение проводится насыщенным растворорм сульфата аммония рН 7,2 при температуре 4-6°С. К 100 г белкового раствора прикапывают 25 г раствора сульфата аммония. Через 12 часов полученную суспензию центрифугируют при 6500 об/мин и декантируют. Осадок отбрасывают, а к супернатанту массой 120 г прикапывают 52 г насыщенного раствора сульфата аммония. После экспозиции в 12 часов суспензию центрифугируют при 6500 об/мин и декантируют. Супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в 50 мл рабочего буферного раствора и добавляют 63 г раствора сульфата аммония. Через 12 часов полученную суспензию центрифугируют при 6500 об/мин и декантируют. Супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в минимальном объеме рабочего буферного раствора - 50 мл и концентрируют на ячейке Amicon с мембранами на 10 кД.

III. Гельфильтрация

Концентрат объемом 11 мл фильтруют через фильтры Millipore с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат наносят на колонку с гелем Sephacryl S200 Superfine (25×100) со скоростью 1,2 мл/мин в рабочем буферном растворе, контролируя оптическую плотность при длине волны 280 нм.

S-антиген-содержащие фракции коллекционируют и объединяют. Объем объединенных фракций составляет 26 мл. Полученный раствор S-антигена диализуют против 0,15 М натрий-фосфатного буферного раствора рН 7,2.

Таблица 1Название пробыОбъем пробы, млS-антигенОбщий белок по БредфордS-антиген/ Белокмг/млв объеме, мгмг/млв объеме, мгПосле первого 50% осаждения501,34674,722360,28После второго 50% осаждения501,26633,601800,36Нанесено на колонку с Sephacryl S200115,456015,641720,36Первая фракция500,72361,80900,40Вторая фракция260,62160,77200,80Третья фракция1010,0110.44450,02

Диализат подвергают анализу (см. табл.1). Электрофоретическая чистота полученного предложенным методом S-антигена составляет 80% и более.

Использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом:

- повысить чистоту целевого продукта за счет трехэтапного солевого фракционирования экстракта насыщенным раствором сульфата аммония и использования сорбента с более высокой разделяющей способностью;

- увеличить выход ретинального S-антигена за счет сокращения количества стадий получения чистого целевого продукта;

- сократить время получения за счет отсутствия стадии очистки.

Источники информации

1. Твердофазная иммуноферментная тест-система для выявления антител к ретинальному S-антигену и ее использование в комплексном иммунологическом обследовании офтальмологических больных // Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук - Челябинск, 2000. С.3-14., Яковлева В.Г. (Научный руководитель Сибиряк С.В.)

2. Dorey С., Cozette et al. A Simple and Rapid Method for Isolation of Retinal S Antigen // Ophtalmic Research, No. 14, 1982, p.249-255.

3. Waldon B. Wacker at al. Experimental allergic uvetis. Characterization, and localization of a soluble uveitopathogenic antigen from bovine retina // The Journal of Immunology. Vol.119, No. 6, 1977, p.1949-1957.

4. Daniel A. Beneski, Larry A. Donoso et al. Human Retinal S-antigen // Investigative Ophthalmology & Visual Science. Vol.25, 1984, p.686-690.

5. E.Kasp, J.P.Banga, et al. An Improved Method for the Purification of Retinal S-antigen Using Selective Hydrophobic Absorption Chromatography // Journal of Immunological Methods. No. 100, 1987, p.147-152.

6. Kovachev D., Tzanev D., Pencheva D. Modified Method for Isolation of Retinal S-Antigen Suitable for ELISA Diagnosis of Uveoretinitis, 1990 p.143-152.

Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и используется для получения раствора ретинального S-антигена, который используется в качестве маркера для диагностики офтальмологических заболеваний.

Способ получения ретинального S-антигена из сетчатки глаз крупного рогатого скота (КРС) осуществляется путем измельчения, экстрагирования, центрифугирования, осаждения, хроматографии, при этом экстракцию ретинального S-антигена осуществляют при температуре 4°С в 0,05 М трис-соляная кислота буферном растворе, рН 7,6, содержащем 0,04% азида натрия, осаждение проводят в три этапа насыщенным раствором сульфата аммония рН 7,2, первый этап которого осуществляют насыщением экстракта раствором сульфата аммония рН 7,2 до 20% по массе, второй этап - до 50% с дальнейшим центрифугированием осадка и растворением его, и затем вновь до 50% насыщения сульфатом аммония, осадок после центрифугирования собирают и растворяют в минимальном количестве трис-соляная кислота буферном растворе, рН 7,6, содержащем 0,04% азида натрия; для выделения S-антигена из полученного раствора используют Sephacryl S-200 Superfine, концентрирование до необходимого объема проводят по содержанию общего белка 0,3-2,0 мг/мл через мембраны с размером пор 10 кД, а проведение хроматографической очистки методом гельфильтрации на Sephacryl S-200 Superfine осуществляют на колонке 25×100 со скоростью 1,2 мл/мин в буферном растворе трис-соляная кислота рН 7,6, S-антигенсодержащие фракции коллекционируют и объединяют, затем проводят диализ против 0,15 М натрий-фосфатного буферного раствора рН 7,2. Изобретение обеспечивает увеличение выхода S-антигена, сокращение времени и достижение необходимой чистоты. 1 табл.

Способ получения ретинального S-антигена из сетчатки глаз крупного рогатого скота путем измельчения, экстрагирования, центрифугирования, осаждения, хроматографии, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют при температуре 4°С в 0,05 М трис-соляная кислота буферном растворе, рН 7,6, содержащем 0,04% азида натрия, осаждение проводят в три этапа насыщенным раствором сульфата аммония рН 7,2, первый этап которого осуществляют насыщением экстракта раствором сульфата аммония рН 7,2 до 20% по массе, второй этап - до 50% с дальнейшим центрифугированием осадка и растворением его, и затем вновь до 50%-ного насыщения сульфатом аммония, осадок после центрифугирования собирают и растворяют в минимальном количестве трис-соляная кислота буферном растворе, рН 7,6, содержащем 0,04% азида натрия, для выделения S-антигена из полученного раствора используют Sephacryl S-200 Superfine, концентрирование до необходимого объема проводят по содержанию общего белка 0,3-2,0 мг/мл через мембраны с размером пор 10 кД, а проведение хроматографической очистки методом гельфильтрации на Sephacryl S-200 Superfine осуществляют на колонке 25×100 со скоростью 1,2 мл/мин в буферном растворе трис-соляная кислота рН 7,6, S-антиген-содержащие фракции коллекционируют и объединяют, затем проводят диализ против 0,15 М натрий-фосфатного буферного раствора рН 7,2.