СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ СЕКРЕТОРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ЧЕЛОВЕКА - SIgA Российский патент 2013 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, иммунохимии, а, именно, к способу получения поликлональной моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина A (SIgA) человека, не содержащей в исходном состоянии антител к лактоферрину.

Слизистые оболочки человека постоянно подвергаются воздействию разнообразных чужеродных веществ и болезнетворных микроорганизмов. Защиту слизистых осуществляет система местного иммунитета. Важную роль в системе местного иммунитета играет секреторный иммуноглобулин А (SIgA).

Секреторный IgA (молекулярная масса 380 кДа) отличается от сывороточного мономерного IgA (молекулярная масса 170 кДа) тем, что состоит из 2-х молекул IgA и так называемого секреторного компонента (SC) (молекулярная масса 90 кДа). Таким образом, «маркером» секреторного IgA является SC-компонент.

Для оценки местного иммунитета в секретах слизистых кишечного, респираторного, урогенитального трактов, в научно-исследовательской работе важное значение имеет качественное и количественное определение секреторного IgA (SIgA). Исследования проводятся с помощью методов иммуноэлектрофореза, радиальной иммунодиффузии, иммуноферментных тест-систем с использованием моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина А (SIgA) человека. Такая сыворотка содержит специфические антитела к SC-компоненту, которые «работают» по SC-компоненту с молекулой SIgA, а также со свободным SC-компонентом и не взаимодействуют с сывороточным мономерным IgA.

Известные современные способы получения поликлональной моноспецифической антисыворотки против SIgA человека [1, 2, 3, 4] включают получение антигена, которым служит SIgA, выделенный из женского молозива; введение антигена животным (иммунизация); получение от продуцента сыворотки, в которой содержатся специфические антитела к антигенным детерминантам (наружным) SC-компонента; адсорбцию полученной антисыворотки.

Наиболее близким способом получения поликлональной моноспецифической сыворотки против SIgA человека является способ, описанный в фармакопейной статье «Сыворотка диагностическая моноспецифическая против секреторного иммуноглобулина А (SIgA) человека сухая» [3]. Согласно этому способу собираем женское молозиво через 2-3 дня после родов. После обезжиривания (центрифугирование 2 часа на холоду при 20000 об/мин) и удаления казеина (доведение рН 1М уксусной кислотой до 4,6, что вызывает выпадение казеина в осадок, центрифугирование) выделяем глобулиновую фракцию, содержащую SIgA, осаждением надосадка сульфатом аммония до 33% насыщения, полученный осадок растворяем и диализуем против 0,1М трис-НСl-буфера с рН 7,4, содержащего 0,15М NaCl. Эта фракция кроме целевого белка SIgA содержит примеси IgG, IgM, мономерный IgA, лактоферрин, альбумин и др. Выделяем SIgA из глобулиновой фракции гель-фильтрацией на сефадексе G-200 (разделение по молекулярному весу). Для последующей очистки первый пик, содержащий SIgA, концентрируем и подвергаем гель-фильтрации на сефарозе 6В.

При этом способе очищенный 1% раствор SIgA в иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) дает одну линию преципитации с антисывороткой ко всем белкам нормальной сыворотки крови человека и одну линию преципитации с антисывороткой ко всем белкам молозива человека.

Иммунизация коз таким антигеном проводится по стандартной схеме: 2, 4, 6, 8 мг/мл SIgA в забуференном физрастворе + равный объем полного адъюванта Фрейнда (при первой иммунизации) или неполного адъюванта Фрейнда (при последующих иммунизациях) вводят экспериментальным животным (козам) 1 раз в неделю в течение 3-4 недель [6]. Забор крови проводят через 7-10 дней после последней иммунизации.

При контроле полученной сыворотки против секреторного IgA в иммуноэлектрофорезе с нормальной сывороткой человека и с цельным молозивом человека обнаруживаются кроме специфических антител к SC-компоненту также антитела к другим антигенным детерминантам молекулы IgA (α-цепям, легким цепям) и ряд примесных антител: к лактоферрину, к IgG, IgM, альбумину. Специфических антител к SC-компоненту образуется значительно меньше, т.к. он имеет всего 2 антигенные детерминанты в силу своей маленькой молекулярной массы. К лактоферрину образуется значительное количество антител, т.к. он в силу своих физико-химических свойств «липнет» к антигену.

Для придания сыворотке моноспецифичности освобождаемся от примесных антител (к IgA, IgG, IgM, альбумину) путем адсорбции [7] исходной сыворотки сорбентами из биологических жидкостей, которые не содержат SIgA и SC-компонент. Такими биологическими жидкостями для сорбентов являются: нормальная сыворотка человека, сыворотки больных IgA-миеломой с полимером IgA, препараты иммуноглобулинов и лактоферрин. Адсорбция нормальной сывороткой человека и миеломной IgA-сывороткой обязательна для любых способов получения моноспецифической сыворотки против SIgA при иммунизации цельной молекулой SIgA.

Для приготовления сорбента из лактоферрина выделяем его из надосадка глобулиновой фракции, полученной при осаждении сульфатом аммония до 33% насыщения. Этот надосадок осаждаем сульфатом аммония до 80% насыщения, таким образом получая фракцию лактоферрина в осадке, который растворяем в 0,01М фосфатном буфере рН 8,0, диализуем против этого же буфера, выделяем иммунохимически чистый лактоферрин с помощью градиентной ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. который в виде 1% препарат не содержит примесей, при контроле в иммуноэлектрофорезе с антисывороткой ко всем белкам молозива человека дает одну линию преципитации.

Из полученного препарата лактоферрина готовим сорбент и с его помощью проводим адсорбцию сыворотки против секреторного IgA. Адсорбция сыворотки против SIgA включает в себя несколько стадий:

приготовление сорбента (с помощью глутарового альдегида) из очищенного лактоферрина, подбор соотношения сорбента и сыворотки против SIgA - пробная адсорбция, основная адсорбция, контроль чистоты полученной сыворотки. Адсорбция сыворотки против SIgA лактоферрином приводит к снижению титра специфических антител к SIgA. При значительной потере специфической активности проводим концентрацию препарата.

Таким образом, этот способ получения сыворотки против SIgA дорогой, трудоемкий, т.к. включает в себя получение дополнительного белка лактоферрина. который требуется для получения сорбента для дополнительной адсорбции сыворотки против SIgA лактоферрином.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа получения поликлональной моноспецифической сыворотки против SIgA человека, не содержащей в исходном состоянии примесных антител к лактоферрину, более простым и технологически пригодным способом. Особенностью получения сыворотки против SIgA при иммунизации цельной молекулой SIgA является то, что целевых антител, т.е. специфических антител к SC-компоненту, образуется значительно меньше, чем антител к другим антигенным детериминантам молекулы IgA и примесных антител (к α-цепям IgA, к лактоферрину, к IgG, к легким цепям и др.). В связи с этим дополнительная адсорбция является весьма нежелательной, т.к. приводит к снижению титра целевых антител. В конечном итоге требуется концентрирование полученной сыворотки для удовлетворения требованиям фармакопейной статьи.

Поставленная задача достигается путем разработки способа, который предусматривает дополнительную очистку антигена SIgA от примеси лактоферрина путем адсорбции его BrCN-активированной гепарин-сефарозой. Лактоферрин в силу своих физико-химических свойств связывается с гепарином, что позволяет использовать BrCN-активированную гепарин-сефарозу для удаления лактоферрина [5] при очистке антигена SIgA. Иммунизация животных таким антигеном приводит к получению исходной антисыворотки без примесных антител к лактоферрину.

Заявленный способ изобретения осуществляется на следующем примере.

Собираем женское молозиво через 2-3 дня после родов. После обезжиривания (центрифугирование 2 часа на холоду при 20000 об/мин) и удаления казеина (доведение рН 1М уксусной кислотой до 4,6, что вызывает выпадение казеина в осадок, центрифугирование) выделяем глобулиновую фракцию, содержащую SIgA, осаждением надосадка сульфатом аммония до 33% насыщения, полученный осадок растворяем и диализу ем против 0,1М трис-НСl-буфера с рН 7,4, содержащего 0,15М NaCl. Эта фракция кроме целевого белка SIgA содержит примеси IgG, IgM, мономерный IgA, лактоферрин, альбумин и др. Выделяем SIgA из глобулиновой фракции гель-фильтрацией на сефадексе G-200 (разделение по молекулярному весу). Для последующей очистки первый пик, содержащий SIgA, концентрируем и подвергаем гель-фильтрации на сефарозе 6 В. На этом этапе очищенный антиген дополнительно подвергаем сорбции бач-методом на BrCN-активированной гепарин-сефарозе в 0,1М боратном буфере, рН 8,0 с 0,5 М NaCl в соотношении не менее 10 мг антигена/5 мл на 1 мл сорбента в течение 1 часа при комнатной температуре. Элюцию проводим тем же буфером, получая SIgA без примеси лактоферрина.

Очищенный 1% раствор SIgA в иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) дает одну линию преципитации с антисывороткой ко всем белкам нормальной сыворотки крови человека и одну линию преципитации с антисывороткой ко всем белкам молозива человека.

Иммунизация коз таким антигеном проводится по стандартной схеме: 2, 4, 6, 8 мг/мл SIgA в забуференном физрастворе + равный объем полного адъюванта Фрейнда (при первой иммунизации) или неполного адъюванта Фрейнда (при последующих иммунизациях) вводят экспериментальным животным (козам) 1 раз в неделю в течение 3-4 недель [6]. Забор крови проводят через 7-10 дней после последней иммунизации.

При контроле полученной сыворотки против секреторного IgA в иммуноэлектрофорезе с нормальной сывороткой человека и с цельным молозивом человека обнаруживаются кроме специфических антител к SC-компоненту также антитела к другим антигенным детерминантам молекулы IgA (α-цепям, легким цепям) и ряд примесных антител: к IgG, IgM, альбумину, но не обнаруживаются антитела к лактоферрину.

Для придания сыворотке моноспецифичности освобождаемся от примесных антител (к IgA, IgG, IgM, альбумину) путем адсорбции [7] исходной сыворотки сорбентами из нормальной сыворотки человека, сыворотки больных IgA-миеломой с полимером IgA, препаратов иммуноглобулинов. Адсорбция нормальной сывороткой человека и миеломной IgA-сывороткой обязательна для любых способов получения моноспецифической сыворотки против SIgA при иммунизации цельной молекулой SIgA. Адсорбции антител к лактоферрину не требуется.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка более простого и технологичного способа, позволяющего очистить антиген от примеси лактоферрина на конечном этапе выделения SIgA из женского молозива с помощью сорбента BrCN-активированная гепарин-сефароза; при иммунизации животных очищенным от лактоферрина антигеном получить исходную антисыворотку, не содержащую антител к лактоферрину, вследствие чего не проводить операции по получению лактоферрина и операции по адсорбции антисыворотки лактоферрином; повысить качество антисыворотки, сохранив ее специфическую активность благодаря снятию стадии адсорбции антисыворотки лактоферрином.

Литература

1. Герман Г.П., Чернохвостова Е.В., Гольдерман С.Я. Изучение секреторного иммуноглобулина А человека. ЖМЭИ. 1975. №10, с.102-106.

2. Захарова Н.А., Гаврилова Е.М., Шаханина К.Л., Панурина Р.Л. Выделение секреторного IgA и лактоферрина из человеческого молозива и получение к ним моноспецифических антисывороток. ЖМЭИ. 1977. №7, с.116-120.

3. Иммунологические методы. Под редакцией Г. Фримеля. Изд-во «Медицина», Москва. 1987, с.401-403.

4. ФС 42-296 ВС-89 Фармакопейная статья «Сыворотка диагностическая моноспецифическая против секреторного иммуноглобулина A (SIgA) человека сухая».

5. Mary Boesman-Finkelstein and Richard A. Finkelstein. Sequential purification of lactoferrin, lyzozyme and secretory immunoglobulin A from human milk. FEBS Letters. 1982. V.144, N 1, p.1-5.

6. Иммунологические методы. Под редакцией Г.Фримеля. Изд-во «Медицина», Москва. 1987, с.13-14.

7. Иммунологические методы. Под редакцией Г.Фримеля. Изд-во «Медицина», Москва. 1987, с.428-430.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, иммунохимии, а именно к способу получения поликлональной моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина A (SIgA) человека, не содержащей в исходном состоянии примесных антител к лактоферрину. Поликлональная моноспецифическая сыворотка против SIgA не содержит примесных антител к лактоферрину, что достигается дополнительной очисткой антигена от примеси лактоферрина на конечном этапе выделения SIgA из женского молозива с помощью сорбента BrCN-активированная гепарин-сефароза. Сыворотка против SIgA может быть использована для качественного и количественного определения секреторного IgA с помощью иммуноэлектрофореза, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментных тест-систем в секретах слизистых кишечного, респираторного, урогенитального трактов, в научно-исследовательской работе. 1 пр.

Способ получения поликлональной моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина А человека - SIgA, включающий выделение антигена из женского молозива путем освобождения его от жира, казеина, получение глобулиновой фракции осаждением сульфатом аммония до 33% насыщения, очистку SIgA гельфильтрацией, иммунизацию животных полученным антигеном SIgA, очистку лактоферрина из надосадка глобулиновой фракции осаждением сульфатом аммония до 80% насыщения, ионообменную хроматографию полученного осадка, приготовление из лактоферрина сорбента, проведение адсорбции антисыворотки от антител к примесям и антител к лактоферрину, отличающийся тем, что очищенный антиген для иммунизации животных SIgA дополнительно подвергается очистке путем сорбции на BrCN-активированной гепарин-сефарозе для удаления примеси лактоферрина.