СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СПЕРМОПЛАЗМЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ МУЖСКОЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/487 

Изобретение относится к медицине, а именно к физиологии репродукции.

В конце XX начале XXI века во всем мире происходит снижение качества репродуктивного здоровья мужчин. Явление снижения сперматогенной функции, по всей вероятности, служит отражением возрастающего воздействия на организм человека повреждающих факторов, встречающихся в окружающей среде, на производстве и быту. Стандартные методы диагностики не всегда позволяют судить о причинах изменения функций сперматозоидов. Оценка показателей спермограммы в значительной степени субъективна и зависит от характеристик исследуемого образца. Кроме того, результаты анализа эякулята не всегда достаточно надежны с клинической точки зрения, так как в ряде случаев фертильность бывает не нарушена и при значительных отклонениях спермограммы от нормы, в то время как бесплодие может наблюдаться и у мужчин с нормозооспермией. В этой связи в очередной раз встает вопрос о необходимости разработки и внедрения в клиническую практику дополнительных методов оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов.

Антиокислительная активность спермоплазмы связана с наличием в ней ряда антиоксидантов, угнетающих радикалообразование на различных фазах цепной реакции свободно-радикального окисления. Интегральной величиной антиоксидантного потенциала спермоплазмы является ее суммарная антиокислительная активность, то есть способность эякулята угнетать свечение модельной системы, в которой протекают реакции свободно-радикального окисления. Суммарная антиокислительная активность определяется различными ферментными и неферментными компонентами спермоплазмы. Следовательно, можно предположить, что антиокислительная активность спермоплазмы не влияет на формирование половых клеток, так как образование основного объема спермоплазмы происходит на уровне добавочных половых желез. Незрелые сперматозоиды с повышенной способностью к генерации активных форм кислорода могут оказывать свое повреждающее действие на полноценные половые клетки до того момента, как последние смешаются с основным объемом спермоплазмы, являющейся основным источником антиоксидантов в эякуляте.

Прототипом является метод определения суммарной антиокислительной активности спермоплазмы, заключающийся в измерении уровня активных форм кислорода, образуемых при добавлении к плазме люминола и катализатора пероксидазы хрена, с последующим определением уровня активных форм кислорода при добавлении эквивалентного количества водного раствора Trolox (Lewis et al.Total antioxidant capacity of seminal plasma is different in fertile and infertile men. Fertil Steril. 1995, 64(4), p. 868-870). Антиокислительная активность в методе определена количественно и выражена как Trolox эквивалент. Однако применяемые реактивы нестабильны, способ достаточно трудоемок из-за необходимости многочисленного титрования.

Технический результат - упрощение способа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

- В качестве модельной системы используют 20 мл фосфатного буфера (KH₂PO₄ - 20 mM, KCl - 105 mM) с цитратом (50 mM) и люминолом (10^-5 М). В течение 10 секунд длится запись темнового тока, после чего вносится инициатор ХЛ - 1 мл 50 mM раствора сернокислого железа (FeSO₄7H₂O). Запись свечения проводят в течение 5 минут.

- Спермоплазму, полученную после центрифугирования семенной жидкости, в объеме 0,1 мл добавляют к модельной системе. В течение 10 секунд длится запись темнового тока, после чего вносят инициатор ХЛ - 1 мл 50 mM раствора сернокислого железа. Конечная концентрация сернокислого железа в среде инкубации составляет 2,5 mM. Запись свечения проводят в течение 5 минут при постоянном перемешивании.

- Антиокислительные свойства спермоплазмы оценивают в процентах от величины угнетения свечения модельной системы при добавлении к последней спермоплазмы по формуле

SAOA=(SMCCП/SMC)×100%,

где SAOA - суммарная антиокислительная активность;

SMC - светосумма модельной системы;

SMCCП - светосумма модельной системы + спермоплазма.

Исследуют индуцированную люминолзависимую хемилюминесценцию эякулята прибором «Хемилюминомер-003». Регистрируют спонтанную светимость, максимальную светимость и светосумму свечения. Полученные результаты выражают в условных единицах по отношению к эталону свечения СФХМ - 1ГОСТ 9411-81, суммарный световой поток которого составляет 5,1×10⁵ квант/сек. По предложенному методу проведена оценка семенной жидкости 10 мужчин, состоящих в браке и имеющих здоровое потомство. Эякулят этих пациентов был использован в программе донорской инсеминации. Диапазон колебаний суммарной антиокислительной активности у здоровых мужчин составил от 35% до 43%.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Клинический пример 1. Наблюдаемый Ж. 29 лет, состоит в первом браке в течение 6 лет, имеет двух здоровых разнополых детей. Работа не имеет профессиональных вредностей. Проживает в г.Уфе.

По данным объективного обследования: нормостеник, рост 188 см, вес 89 кг, привычные интоксикации отсутствуют. Вторичные половые признаки по мужскому типу. Яички D=S, 4 см, плотноэластической консистенции, придатки не изменены.

Per rectum - предстательная железа эластической консистенции, не увеличена, поверхность гладкая, срединная бороздка четкая, семенные пузырьки не пальпируются.

Данные лабораторного обследования

1. Сок предстательной железы - лейкоциты единичные в поле зрения, лецитиновые зерна в большом количестве.

2. Спермограмма - концентрация сперматозоидов 74 млн/мл, подвижность категории «а» - 31%, «в» - 33%, «с» - 10%, «d» - 26%, нормальные морфологические формы 58%, объем 4 мл, серо-белого цвета, рН7,5, вязкость - 0,5 см, лейкоциты менее 1 млн/мл.

3. Уровень гормонов: ФСГ - 0,9 мМЕ/мл (норма), пролактин - 304 мМЕ/мл (норма), тестостерон - 19,5 нг/мл (норма).

4. Исследование мазка из уретры методом полимеразной цепной реакции: Ch. trachomatis - отриц., М. hominis - отриц., М. genitalium - отриц., Ureaplasma - отриц.. N.gonorrhoae - отриц.. Trichomonas - отриц.

5. Кровь на RW, ВИЧ, HBS-ag - отрицательный результат.

Наблюдается в Республиканском центре планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией в течение 3-х лет. В данный период времени наблюдаемый Ж. работал по программе инсеминации спермой донора, его сперма использована для хранения в криоконсервированном виде для проведения процедур донорской инсеминации. Материал применялся для искусственной инсеминации в 23 натуральных циклах у женщин с различной фертильностью, зарегистрировано три нормально развивающиеся беременности.

Для определения антиокислительной активности использован нативный эякулят наблюдаемого.

Показатели Fe²⁺-индуцированной хемилюминесценции модельной системы: СС - 89,93 отн.ед, СпС - 0,33 отн.ед., Мс -39,55 отн.ед.

Показатели Fe²⁺-индуцированной хемилюминесценции модельной системы и спермоплазмы: СС - 31,65 отн.ед, СпС - 0,87 отн.ед., Мс - 13,02 отн.ед.

Резюме: фертильность наблюдаемого доказана рождением двух детей и наступлением трех зарегистрированных беременностей. Данные параметров эякулята согласно стандартному лабораторному исследованию соответствуют нормативам ВОЗ. Показатели Fe²⁺-индуцированной ХЛ соответствуют средним показателям группы контроля. Уровень антиокислительной активности спермоплазмы составил 35,2 %.

Разработанный комплексный метод определения общей антиокислительной активности спермоплазмы рекомендуется применять для оценки мужской инфертильности в клинической урологии как эффективный дополнительный метод диагностики.

Изобретение относится к медицине, а именно к физиологии репродукции. Сущность способа: регистрируют железоиндуцируемую хемилюминисценцию модельной системы, затем проводят повторную регистрацию хемилюминесценции при добавлении спермоплазмы, определяют суммарную антиокислительную активность спермоплазмы по формуле: SAOA=(SMCCП/SMC)·100%, где SAOA - суммарная антиокислительная активность; SMC - светосумма модельной системы; SМССП - светосумма модельной системы + спермоплазма. Эякулят оценивают как фертильный при значении суммарной антиокислительной активности спермоплазмы, равной 35-43%. Применение способа позволяет оценить оплодотворяющую способность сперматозоидов у мужчин.

Способ оценки мужской фертильности путем определения суммарной антиокислительной активности спермоплазмы методом хемилюминесценции, отличающийся тем, что регистрируют железоиндуцируемую хемилюминесценцию модельной системы, затем проводят повторную регистрацию хемилюминесценции при добавлении спермоплазмы, определяют суммарную антиокислительную активность спермоплазмы по формуле:

SAOA=(SMCCП/SMC)·100%,

где SAOA - суммарная антиокислительная активность;

SMC - светосумма модельной системы;

SMCCП - светосумма модельной системы + спермоплазма и при ее значении 35-43% эякулят оценивают как фертильный.