СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ СПЕРМАТОЗОИДОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к области исследования биологических материалов, а именно сперматозоидов, и может быть использовано при проведении функционального теста при оценке их оплодотворяющей способности и для выявления этиопатогенеза патозооспермии.

Ультраструктурный анализ позволяет выявлять аномалии строения ядра головки сперматозоида, наличие акросомы и аномалии ее строения, атипии строения компонентов жгутика сперматозоида и другие детали патологии сперматозоидов и незрелых половых клеток на разных стадиях развития. Ультраструктурное исследование позволяет проводить диагностику генетически обусловленных и функциональных нарушений оплодотворяющей способности сперматозоидов и может быть использовано в качестве прогностического теста.

Снижение фертильности мужчин вносит свой вклад в общую демографическую ситуацию. В последние годы (10-20 лет) в мире ведутся многочисленные исследования репродуктивной функции мужчин. Специалисты различных стран отмечают снижение концентрации сперматозоидов у здоровых мужчин. Так, исследование спермы фертильных доноров в 61 независимом центре показало снижение концентрации сперматозоидов с 1938 по 1990 гг. со 113 до 66 млн/мл. По данным Парижского банка спермы, в среднем концентрация сперматозоидов падает на 2,6% в год. Согласно литературным данным последних лет, уменьшение концентрации сперматозоидов в группах фертильных мужчин колеблется в различных регионах мира. Так, в Швеции с 1985 по 1995 гг. не выявили ухудшения качества спермы, аналогичные данные получены в некоторых штатах США. Однако детальный анализ данных позволяет считать, что, несмотря на неполную сопоставимость и противоречия, они описывают объективно протекающий общий процесс снижения сперматогенной функции человека, который может неодинаково проявляться в различных контингентах обследуемых, географических зонах и при действии тех или иных факторов внешней среды. По данным проведенных в 1991-2001 гг. исследований, в Москве из 1000 мужчин только 10% имеют подвижность сперматозоидов, соответствующую нормативам ВОЗ.

Бесплодием поражено примерно 15% супружеских пар, и у половины из них основным или сопутствующим фактором является инфертильность мужчин. При этом около 30% всех случаев бесплодия относят к так называемому идиопатическому бесплодию, т.е. бесплодию с невыясненной этиологией. Изучение показателей спермограммы на сегодня остается основным видом обследования мужчин при нарушениях фертильности. Ведущими показателями, отражающими оплодотворяющую способность спермы, полагают концентрацию сперматозоидов (их общее количество), подвижность и содержание сперматозоидов нормальной (типичной) морфологии. Хотя у фертильных мужчин эти показатели в общем выше, тем не менее, в группе фертильных и бесплодных мужчин эти показатели могут значительно перекрываться, позволяя предполагать наличие неких не учитываемых в традиционной диагностике факторов, влияющих на фертильность. Это означает, что, основываясь только на показателях спермиологического обследования, нельзя дать достоверный прогноз фертильности, учитывающий не только возможность зачатия, но и исход наступившей беременности.

Разработка схемы комплексного обследования для проведения дифференциальной диагностики бесплодия является определяющим моментом при выборе адекватных методов терапии. Мужское бесплодие - полиэтиологичное заболевание, для которого до сих пор не существует единой классификации, включающей все многообразие его причин и симптомов. Если абстрагироваться от анатомических и иммунологических причин мужского бесплодия и рассматривать процесс оплодотворения на клеточном уровне, то можно выделить две основные причины неудач оплодотворения:

1) недостаточное количество сперматозоидов или их отсутствие в эякуляте;

2) функциональная неполноценность сперматозоидов.

В первом случае для прогноза фертильности достаточно подсчета концентрации и общего количества сперматозоидов, что выявляют при традиционном лабораторном обследовании эякулята на светооптическом уровне. Нарушение функциональных свойств сперматозоидов при обычном светомикроскопическом исследовании в ряде случаев выявить невозможно. Для определения различных параметров взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой разработан ряд функциональных тестов. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью (2001 г.) рекомендует проведение так называемых пенетрационных тестов, которые определяют функцию акросомы. Среди таких тестов можно назвать акросомную реакцию, тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита (HZA - hemizona assay), тест проникновения сперматозоидов сквозь блестящую оболочку ооцита, тест проникновения сперматозоидов в ооцит, лишенный оболочки. Интенсивно разрабатывают тесты, позволяющие определять целостность ДНК сперматозоида, т.к. доказано, что нарушение целостности и степени конденсации ДНК не только влияет на частоту наступления беременности при естественном зачатии или степень оплодотворения при ЭКО, но приводит к спонтанным абортам или инарушениям развития эмбриона. В ряде исследований показано выраженное различие в содержании сперматозоидов с поврежденной ДНК между группами фертильных и инфертильных мужчин. Степень оплодотворения может быть близка к нулевой, если доля сперматозоидов с повреждением ДНК превышает 30% клеток, как при естественном зачатии, так и при внутриматочной инсеминации.

Наряду с вышеупомянутыми тестами для установления этиопатогенеза патозооспермии и для оценки функционального состояния сперматозоидов может быть применен метод ультраструктурного анализа (Брагина и др. Электронно-микроскопическое изучение сперматозоидов и его роль в диагностике мужского бесплодия. «Проблемы репродукции», 2000, №6, стр.62-71). Электронно-микроскопические исследования сперматозоидов позволяют провести качественную и количественную оценку состояния клеточных органоидов, необходимых для выполнения сперматозоидами оплодотворяющей функции:

1) ядра, необходимого для переноса в яйцеклетку генетического материала мужской гаметы;

2) акросомы, с использованием которой осуществляется пенетрация сперматозоидом оболочек яйцеклетки;

3) моторного аппарата - жгутика, с использованием которого преодолевается относительно большое расстояние от влагалища до верхнего отдела яйцевода, где происходит оплодотворение яйцеклетки;

4) базального тельца жгутика - центриоли зрелого сперматозоида, обеспечивающей митотические деления дробления эмбриона.

Исследование ультраструктуры сперматозоидов позволяет выявлять причину их функциональной неполноценности, в ряде случаев дифференцировать генетически обусловленные (например, синдром Картагенера, глобулозооспермия) и индуцированные аномалии, а также позволяет делать прогноз результатов оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона при использовании репродуктивных технологий.

Точность анализа, как известно, во многом зависит от способа подготовки образца, в данном случае, от способа плоскопараллельной заливки пробы сперматозоидов для электронно-микроскопического анализа.

При сниженной подвижности сперматозоидов (астенозооспермия) необходимо исследование аксонемы жгутика сперматозоида, что важно для дифференциальной диагностики генетических дефектов сперматогенеза. Для этого исследуют ультратонкие срезы, строго перпендикулярные аксонеме жгутика. Малейшее отклонение не дает возможности визуализировать строение деталей жгутика, необходимо получение ультратонких срезов, строго перпендикулярных направлению жгутика.

Традиционно исследуют взвесь сперматозоидов со случайно ориентированными жгутиками. Плоскопараллельная заливка дает возможность получения ориентированных срезов и позволяет исследовать необходимое для получения статистически достоверных результатов количество жгутиков сперматозоидов.

Известен способ фиксации сперматозоидов для ультраструктурного исследования (Holstein A., Roosen-Runge Е. Atlas of Human spermatogenesis. 1981 Grosse Verlag, Berlin, p.1-224). Согласно известному способу эякулят после разжижения разбавляют большим объемом фиксатора (в отношении 1 часть эякулята - 20 частей фиксатора). Это делается для того, чтобы разбавить семенную жидкость, содержащую большое количество белков, которые образуют гель после фиксации, глютаровым альдегидом. Эякулят с фиксатором центрифугируют, сливают супернатант, осадок заливают свежей порцией фиксатора (2 мл), после обезвоживания заливают в эпоксидную смолу по стандартной методике для получения ультратонких срезов. Ориентацию сперматозоидов при этом не проводят.

В результате на срезах изучаются случайно ориентированные сперматозоиды, что затрудняет оценку ультраструктуры имеющих полярное расположение органоидов (аксонемы, акросомы, центриоли).

Техническая задача, решаемая посредством разработанного изобретения, состоит в обеспечении установления этиопатогенеза патозооспермии и оценки функционального состояния сперматозоидов.

Технический результат, получаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности установления этиопатогенеза патозооспермии и оценки функционального состояния сперматозоидов.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ плоскопараллельной заливки пробы сперматозоидов для электронно-микроскопического исследования. Разработанный способ включает разбавление эякулята, преимущественно, физиологическим раствором в отношении 1:10-1:20, добавление 0,1-0,2 мл фиксатора, центрифугирование, слив супернатанта с последующим добавлением 1-2 мл свежего фиксатора, нанесение капли фиксатора с взвешенными в нем клетками осадка на предварительно обезжиренный кусочек алюминиевой фольги, инкубацию во влажной камере при комнатной температуре 25-35 мин, промывку фольги с прикрепившимися клетками в 0,1 М буферном растворе, далее по стандартной методике - фиксация в осмиевой кислоте, обезвоживание, заливка в эпоксидную смолу в плоские ванночки, после полимеризации алюминиевую фольгу отделяют от твердой смолы.

При реализации разработанного способа достигают, во-первых, значительное разведение эякулята, предохраняющее от формирования геля, при этом вместо 20-22 мл фиксатора используют 2-2,5 мл и, во-вторых, обеспечивают ориентацию сперматозоидов в образце.

В качестве фиксатора предпочтительно используют глутаровый альдегид. Для получения раствора фиксатора 90 мл 0.1 М фосфатного или какодилатного буфера смешивают с 10 мл исходного 25% раствора глутарового альдегида.

Разработанное техническое решение относится к области подготовки к исследованию с использованием микроскопии путем плоскопараллельной заливки пробы сперматозоидов. Разработанное техническое решение позволяет искать и исследовать клетки с использованием светооптической микроскопии даже при очень небольшой их концентрации. Сложность получения плоскопараллельных препаратов сперматозоидов состоит в том, что эти клетки не прикрепляются к покровным стеклам, обычно используемым в качестве подложки при плоскопараллельной заливке. Поэтому в качестве подложки предложено использовать алюминиевую фольгу, к которой прикрепляли фиксированные клетки.

Способ предпочтительно реализуют следующим образом.

Эякулят, полученный путем мастурбации, помещают в термостат (37°С) на 15-30 мин для разжижения. Эякулят после разжижения переливают в центрифужную пробирку. К эякуляту добавляют изотонический раствор NaCl (физиологический раствор) в соотношении 1:20 и 0,1 мл фиксатора - 2,5% раствора глютарового альдегида на 0.1 М фосфатном или какодилатном буфере (рН 7.2-7.4), центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 2 мл фиксатора и инкубируют при 4°С в течение 60 мин. Полученный зафиксированный материал при необходимости можно хранить в плотно закрытой пробирке при 4°С до 30 суток. Суспензию центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин, тщательно сливают супернатант, наливают 0,3 мл фиксатора, ресуспендируют, помещают на кусочек предварительно обезжиренной (2-3 суток в 96% этаноле) алюминиевой фольги и инкубируют при комнатной температуре во влажной камере 30 мин.

Фольгу с прикрепившимися клетками помещают в пробирку с буфером, использованным для разведения фиксатора, и инкубируют при 4°С в течение 15 мин. Осторожно сливают буфер и фиксируют клетки 1% раствором четырехокиси осмия на 0,1М фосфатном буфере (рН 7.2-7.4). Раствор готовят ex tempore из исходного 2% водного раствора четырехокиси осмия. Фиксируют в течение 1-1,5 час при 4°С в плотно закрытой пробирке, избегая прямого света. Сливают осмиевый фиксатор, помещают фольгу с клетками в 50% этанол на 5 мин. Помещают фольгу с клетками в насыщенный раствор уранилацетата в 70% этаноле и инкубируют в закрытой пробирке 12-14 час. Проводят дегидратацию материала в спиртах возрастающей концентрации (96% этанол - 30 мин, 100% этанол - 2 смены по 30 мин) и абсолютном ацетоне или окиси пропилена - 30 мин. Затем проводят предварительную пропитку материала в 3 смесях абсолютного ацетона или окиси пропилена с эпоксидной смолой. Смесь наливают в формочку, которую помещают в плотно закрытую посуду. В каждой смеси материал инкубируют по 1 часу при 20°С. Наливают в формочку жидкую эпоксидную смолу и проводят полимеризацию 24 час при температуре 37°С и 24 час - при температуре 56°С.

Полученную пластину из эпоксидной смолы, на поверхности которой находятся сперматозоиды, освобождают от металлической фольги. С использованием светооптического микроскопа выбирают сперматозоиды для изучения, получают ультратонкие срезы и контрастируют их цитратом свинца, после чего они пригодны для изучения в электронном микроскопе. Изучение сперматозоидов оптимально производить при увеличении 5000х (общий просмотр) и 16000х-18000х (исследование органоидов). Для определения аномалий тонкого строения жгутиков срезы следует изучать при увеличении 20000х-25000х.

Разработанный способ плоскопараллельной заливки позволяет по сравнению с известными способами исследования сперматозоидов, во-первых, исследовать единичные сперматозоиды в образцах с очень низкой их концентрацией (при олигозооспермии), а также проводить исследование нужных зон сперматозоидов прицельно, а не при случайном распределении.

Изобретение относится к лабораторным методам исследования. Сущность способа подготовки пробы сперматозоидов для электронно-микроскопического исследования: осуществляют разбавление эякулята в отношении 1:10-1:20 физиологическим раствором, фиксацию 2,5% раствором глутарового альдегида. Полученный зафиксированный материал в виде капли фиксатора с взвешенными после ресуспендирования в нем клетками осадка наносят на предварительно обезжиренный кусочек алюминиевой фольги, инкубируют во влажной камере при комнатной температуре 25÷35 мин, осуществляют промывку фольги с прикрепившимися клетками в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2-7,4 с последующей фиксацией в 1% осмиевом фиксаторе и обезвоживанием, помещением фольги с клетками в насыщенный раствор уранилацетата в 70% этаноле и инкубированием в закрытой пробирке 12-14 часов. Далее проводят дегидратацию и осуществляют заливку эпоксидной смолой, после полимеризации алюминиевую фольгу отделяют от полученной пластины из эпоксидной смолы, на поверхности которой находятся сперматозоиды. Использование данного способа позволяет исследовать единичные сперматозоиды в образцах с очень низкой концентрацией и получать ультратонкие ориентированные срезы сперматозоидов.

Способ подготовки пробы сперматозоидов для электронно-микроскопического исследования сперматозоидов, включающий разбавление эякулята в соотношении
1:10-1:20, фиксацию 2,5%-ным раствором глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4), центрифугирование, слив супернатанта с последующим добавлением к осадку свежего фиксатора - глутарового альдегида, заливку пробы в эпоксидную смолу в плоские ванночки, отличающийся тем, что разбавление эякулята осуществляют физиологическим раствором, полученный зафиксированный материал в виде капли фиксатора с взвешенными после ресуспендирования в нем клетками осадка наносят на предварительно обезжиренный кусочек алюминиевой фольги, инкубируют во влажной камере при комнатной температуре 25÷35 мин, осуществляют промывку фольги с прикрепившимися клетками в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2-7,4 с последующей фиксацией в 1%-ном осмиевом фиксаторе и обезвоживанием, помещением фольги с клетками в насыщенный раствор уранилацетата в 70%-ном этаноле и инкубировании в закрытой пробирке 12-14 ч, после чего проводят дегидратацию и осуществляют заливку эпоксидной смолой, после полимеризации алюминиевую фольгу отделяют от полученной пластины из эпоксидной смолы, на поверхности которой находятся сперматозоиды.