Способ прогнозирования исходов экстракорпорального оплодотворения Российский патент 2022 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности к урологии, репродуктологии, андрологии, а именно к лабораторной диагностике мужского фактора бесплодия, и может быть использовано для пронозирования исходов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в процессе диагностики и лечения мужского бесплодия с применением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

В настоящее время широко проводится лечение бесплодных пар с применением вспомогательных репродуктивных технологий (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 30 августа 2012 г. №107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению"). Выбор метода репродуктивной технологии у конкретной пары, прогноз наступления беременности, наличие или отсутствие патологии при развитии плода напрямую зависит от показателей здоровья женщины и качества спермы партнера. Эякулят оценивают в соответствии с рекомендациями ВОЗ, исследуют концентрацию и количество сперматозоидов, их подвижность и особенности морфологии (Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макарова. Науч. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. М.: Капитал Принт, 2012. [WHO Laboratory manual for the xamination and processing of human semen. Trans, from English by N.P. Makarov. Scientific ed. by L.F. Kurilo. 5th ed. Moscow: Kapital Print, 2012. (In Russ.)]. Объем эякулята (мл) определяют гравиметрически, рассчитывая разницу массы пустого контейнера и контейнера с материалом обследуемых. Вязкость образца оценивают по длине нити (мм), образующейся при извлечении стеклянной палочки из эякулята. Для подсчета концентрации и общего количества сперматозоидов, а также оценки их подвижности используют анализатор спермы (SQA-V, «MES», Израиль). При низкой концентрации сперматозоидов (менее 1 мл/мл) их подсчет проводят в камере Горяева.

Известен способ диагностики ранних репродуктивных нарушений у мужчин (Способ диагностики ранних репродуктивных нарушений у мужчин Тарасова М.Н., 2009 https://yandex.ru/patents/doc/RU2413949C1_20110310), основанный на определении в сыворотке крови концентрации цитокинов IL-8, IL-10 и IL-1RA, а затем вычисляют диагностический индекс DI по формуле DI=0,037⋅IL-8+(-0,033)IL-10+0,022⋅IL-1RA-3,99, и при DI более 0 диагностируют ранние нарушения репродуктивной функции у мужчин, а при DI менее 0 делают заключение об отсутствии лабораторных признаков нарушений мужской репродуктивной функции. Недостатками указанного способа является невозможность его проведения в большинстве клинико-диагностических лабораторий из-за отсутствия необходимого оборудования, дороговизна, так как необходимо проводить исследование сразу с тремя наборами, один из которых (IL-1RA) производится в РФ в малых количествах и имеются трудности с поставкой его клинико-диагностическим лабораториям.

Способов, позволяющих точно и объективно прогнозировать инфертильность эякулята, в изученных нами патентных источниках и научной медицинской литературе не обнаружено.

Задачей заявляемого решения является разработка критерия косвенной оценки качества сперматозоидов по уровню белка связывающего жирные кислоты (БСЖК) для прогнозирования исходов экстракорпорального оплодотворения.

Технический результат: повышение точности прогнозирования исходов ЭКО, который обеспечивается за счет количественного критерия, основанного на результатах лабораторного исследования спермы мужчины, определяющего наличие репродуктивных нарушений у мужчин (инфертильности эякулята), что позволяет повысить эффективность программы ВРТ за счет точного отбора мужчин на этапе планирования беременности в супружеской паре; экономическая эффективность метода за счет возможности применения до начала процедуры ЭКО.

Указанный результат достигается путем определения концентрации белка связывающего жирные кислоты в эякуляте мужчины.

Способ осуществляется следующим образом: у обследуемого мужчины производят сбор эякулята после 2-4 дней полового воздержания. Семенную плазму отделяют путем центрифугирования образцов эякулята при 3000 об/минуту в течение 10 минут. Концентрацию БСЖК определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы «Белок, связывающий жирные кислоты - ИФА - БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия; артикул А-9104). Оптическую плотность проб регистрируют на вертикальном фотометре StatFax 3200 (Awareness, США).

Необходимые реактивы: Набор реагентов «Белок, связывающий жирные кислоты - ИФА - БЕСТ» предназначен для количественного определения концентрации белка, связывающего жирные кислоты, в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа, «Вектор-Бест», Россия.

Ход определения: процедура основана на принципах конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (конкурентной ELISA). Биотинилированный и небиотинилированный антиген конкурируют за ограниченное число связывающих мест специфических антител, иммобилизированных на твердой фазе. Количество биотинилированного антигена обратно пропорционально концентрации анализируемого вещества в образце. После установления равновесия и отмывания несвязанного антигена, оставшийся связанный антиген метят антителами к биотину, конъюгированными с белком, связывающим жирные кислоты. Затем его количество регистрируют фотометрически на длине волны 405 после проведения ферментативной реакции с Субстратом. Концентрацию антигена рассчитывают путем экстраполяции полученных данных на калибровочный график, построенный по результатам анализа с серией Стандартов, выражают в нг/мл (Инструкция к набору для ИФА «Белок, связывающий жирные кислоты - ИФА - БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия, артикул А-9104), и при значении от 0 до 0,95 нг/мл прогнозируют инфертильность эякулята, то есть неблагоприятный исход экстракорпорального оплодотворения, при значении более 0,95 нг/мл эякулят рассматривают как фертильный, прогнозируя благоприятный исход ЭКО.

Таким образом, способ обеспечивает точность прогнозирования исходов ЭКО за счет оценки фертильности эякулята, а также повышает достоверность выявления мужского фактора бесплодия на доклинических стадиях, что позволяет как можно раньше ставить на учет пациента, проводить ему своевременную адекватную терапию, прогнозировать исход применения вспомогательных репродуктивных технологий, в частности экстракорпорального оплодотворения.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Пациент Д., 31 год. Жалоб не предъявляет. Брак 1-й, в браке 6 лет. Частота половых сношений в паре два раза в неделю, половая жизнь регулярная, без применения контрацептивных средств. Случаев беременности в паре не зарегистрировано. Копулятивной дисфункции не выявлено. В течение всей жизни к урологу не обращался, соматическими заболеваниями не болел. Жена обследована гинекологом - диагностирован эндометриоз, нарушена проходимость маточных труб. Из анамнеза жизни пациента: родился вторым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Перенесенные заболевания - эпидемический паротит, болезнь Боткина, туберкулез, заболевания, передающиеся половым путем, отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. Проведено 2 анализа эякулята с интервалом 6 месяцев. Результат спермограммы перед назначением семейной паре лечения: объем 3,4 мл; вязкость 2 мм; цвет серо-белый; количество сперматозоидов в 1 мл 62 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 210,8 млн. Живых - 67%. Подвижность: быстро прогрессивное движение - 33%, 24% - непрогрессивное движение, 5% - малоподвижные, 38% - неподвижные. Морфология: 82% - нормальные формы, 8% - патология головки, 5% - патология шейки, 5% - патология хвоста. Лейкоциты - нет, рН 7,7. Заключение по анализу спермы: астенозооспермия.

Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки - патологии не выявлено. Концентрация БСЖК в эякуляте 1,8 нг/мл.

Диагноз: Бесплодие в браке.

По рекомендации гинеколога семейной паре было назначено лечение с применением вспомогательных репродуктивных технологий -экстракорпоральное оплодотворение спермой мужа. Через 2 месяца у партнерши наступила беременность.

Данный пример иллюстрирует связь достаточной концентрации БСЖК в сперме с благоприятным исходом экстракорпорального оплодотворения.

Пример 2. Пациент С., 29 лет. Жалоб не предъявляет. Брак 1-й, в браке четыре года. Частота половых сношений в паре три раза в неделю. Половая жизнь регулярная, частота половых сношений в паре три раза в неделю, контрацептивные средства не использовались. Случаев беременности в паре не зарегистрировано. Копулятивной дисфункции не выявлено. Жена обследована гинекологом - патологии нет. Из анамнеза жизни пациента: родился первым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Из перенесенных заболеваний - в детстве часто ОРВИ, в течение последних 5 лет проходит лечение по поводу герпетической инфекции; эпидемический паротит, другие заболевания, передающиеся половым путем, болезнь Боткина, туберкулез отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. В анализах эякулята (всего сделано четыре в разное время) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед лечением пары: объем 3,0 мл, цвет серо-белый, консистенция - вязкая. Количество сперматозоидов в 1 мл 8 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 24 млн. Живых - 57%. Подвижность: быстро прогрессивное движение - не выявлено, 5% -непрогрессивное движение, 15% - малоподвижные, 80% - неподвижные. Морфология: 26% - нормальные формы, 40% - патология головки, 25% - патология шейки, 5% - патология хвоста, 4% - юные формы. Лейкоциты - единичные, рН 7,8. Заключение по анализу спермы: олигозооспермия, тератоспермия.

Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки. Определена концентрация фолликулостимулирующего гормона лютеинизирующего гормона, пролактина, тестостерона, эстрадиола в сыворотке крови. Результаты в норме. Консультация уролога - патологии не выявлено. Консультация эндокринолога - эндокринологических заболеваний не выявлено. Концентрация БСЖК в эякуляте 0,7 нг/мл.

Диагноз: Бесплодие в браке.

Больной проходил терапию в течение 1 года, у партнерши беременность не наступила. После проведения экстракорпорального оплодотворения через год от начала обследования пары беременность у партнерши также не наступила. При применении метода экстракорпорального оплодотворения спермой донора 2 раза в течение 2-х лет у партнерши наступила беременность, закончившаяся рождением здорового ребенка.

Вышеописанный случай демонстрирует связь низкой концентрации БСЖК в сперме с неблагоприятным исходом экстракорпорального оплодотворения.

Пример 3. Пациент Л., 34 года обратился к андрологу с жалобой на отсутствие детей в браке. Других жалоб не предъявлял. Брак 2-й, в браке три года. Половая жизнь в паре два раза в неделю, регулярная, без применения контрацептивов. Копулятивной дисфункции не выявлено. При обследовании супруги гинекологом патологии не выявлено. Из анамнеза жизни пациента: родился вторым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Перенесенные заболевания - в детстве ветряная оспа в 8 лет; эпидемический паротит, болезнь Боткина, туберкулез, заболевания, передающиеся половым путем, отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. В анализах эякулята (три исследования с интервалом в 5 месяцев) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед назначением лечения: объем 2,6 мл, цвет серо-белый, вязкость по тесту отрыва нити 10 мм. Количество сперматозоидов в 1 мл 18 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 46,8 млн. Живых - 76%. Подвижность: 5% - быстро прогрессивное движение, 5% - непрогрессивное движение, 20% - малоподвижные, 70% - неподвижные. Морфология: 20% - нормальные формы, 40% - патология головки, 35% - патология шейки, 5% - патология хвоста. Лейкоциты - единичные, рН 7,6. Заключение по анализу спермы: олигоастенозооспермия. Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки - патологии не выявлено. В сыворотке крови определяли содержание фолликулостимулирующего гормона лютеинизирующего гормона, пролактина, тестостерона, эстрадиола. Показатели в пределах нормы. Консультация уролога - патологии не выявлено. Консультация эндокринолога - эндокринная система без патологии. Концентрация БСЖК в эякуляте 0,9 нг/мл.

Диагноз: Бесплодие в браке.

Больной проходил терапию в течение 1 года, у партнерши беременность не наступила. После проведения экстракорпорального оплодотворения через год от начала обследования пары беременность у партнерши также не наступила.

Данный случай подтверждает неблагоприятный исход экстракорпорального оплодотворения при использовании эякулята с уровнем БСЖК ниже 0,95 нг/мл.

Пример 4. Пациент О., 35 лет. Жалоб не предъявляет. Брак 1-й, в браке 5 лет. Частота половых сношений в паре более чем три раза в неделю, половая жизнь регулярная, контрацептивны не применялись. Беременность у партнерши не наступала. Копулятивной дисфункции нет. Жена обследована гинекологом - патологии не выявлено. Из анамнеза жизни пациента: родился первым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Из перенесенных заболеваний - в детстве часто ОРВИ; эпидемический паротит, туберкулез, заболевания, передающиеся половым путем, болезнь Боткина отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. В анализах эякулята (всего сделано четыре в разное время) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед лечением пары: объем 4,0 мл, цвет серо-белый, консистенция - вязкая. Количество сперматозоидов в 1 мл 32 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 128 млн. Живых - 46%. Подвижность: 28% - быстро прогрессивное движение, 5% - непрогрессивное движение, 65% - малоподвижные, 2% - неподвижные. Морфология: 85% - нормальные формы, 7% - патология головки, 5% - патология шейки, 3% - патология хвоста. Лейкоциты - нет, рН 7,4. Заключение по анализу спермы: Астенозооспермия. Концентрация БСЖК в эякуляте 0,6 нг/мл.

Диагноз: Бесплодие в браке.

По поводу лечения бесплодия семейной паре было рекомендовано применение вспомогательной репродуктивной технологии - экстракорпорального оплодотворения. Беременность у партнерши не наступила. Больной проходил терапию в течение более 1 года. Концентрация БСЖК в эякуляте после лечения 1,1 нг/мл. Через 15 месяцев от начала обследования пары у партнерши наступила беременность на фоне увеличения концентрации БСЖК в сперме.

Таким образом, использование предложенного способа позволяет обеспечить косвенную оценку качества сперматозоидов, улучшить результат лечения бесплодия в супружеской паре с применением вспомогательных репродуктивных технологий, прогнозировать мужское бесплодие на доклинических стадиях, что позволяет выделять таких пациентов (со сниженной концентрацией в эякуляте белка, связывающего жирные кислоты) в отдельную группу, проводить им адекватный диагностический поиск и своевременную терапию.

Изобретение относится к области медицины, урологии, репродуктологии, андрологии, клинической лабораторной диагностики. В эякуляте мужчины из супружеской пары, до начала процедуры экстракорпорального оплодотворения, предварительно определяют концентрацию белка, связывающего жирные кислоты (БСЖК), и при значении концентрации БСЖК от 0 до 0,95 нг/мл прогнозируют инфертильность эякулята, то есть неблагоприятный исход экстракорпорального оплодотворения, при значении более 0,95 нг/мл эякулят рассматривают как фертильный, прогнозируя благоприятный исход экстракорпорального оплодотворения. Способ позволяет повысить точность прогнозирования исходов ЭКО, что повышает эффективность программы вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ) за счет точного отбора мужчин на этапе планирования беременности в супружеской паре; имеется экономическая эффективность метода за счет возможности применения до начала процедуры ЭКО. 4 пр.

Способ прогнозирования исходов экстракорпорального оплодотворения путем лабораторного анализа спермы, отличающийся тем, что в эякуляте мужчин, до начала процедуры экстракорпорального оплодотворения, предварительно определяют концентрацию белка, связывающего жирные кислоты (БСЖК), и при значении концентрации БСЖК от 0 до 0,95 нг/мл прогнозируют инфертильность эякулята, то есть неблагоприятный исход экстракорпорального оплодотворения, при значении более 0,95 нг/мл эякулят рассматривают как фертильный, прогнозируя благоприятный исход экстракорпорального оплодотворения.