Способ прогнозирования инфертильности эякулята у мужчин Российский патент 2022 года по МПК G01N33/543 G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности к урологии, репродуктологии, андрологии, лабораторной диагностике мужского фактора бесплодия, и может быть использовано для прогнозирования инфертильности эякулята у мужчин.

Центральной проблемой современной репродуктивной медицины является бесплодный брак. Среди причин роста числа бесплодных браков важная роль принадлежит так называемому «мужскому» фактору, заключающемуся в резком снижении фертильности эякулята. Среди причин бесплодия в супружеской паре бесплодие мужчины занимает более 40%. Наиболее эффективным направлением профилактики заболеваемости мужской репродуктивной сферы является выявление и устранение возможности воздействия на человека факторов окружающей и производственной среды, формирование здорового образа жизни. Не менее важна и вторичная профилактика - раннее выявление и лечение начальных стадий мужского бесплодия и предшествующих ему состояний. С этих позиций достоверная диагностика и коррекция нарушений фертильности у мужчины является неотъемлемой частью комплексного лечения бесплодного брака.

Показателями плодовитости спермы являются характеристики его клеточного состава, в частности, концентрация, подвижность и морфологические особенности сперматозоидов. Отмечено, что состав семенной плазмы также оказывает значительное влияние на фертильность эякулята. В последние годы возрос интерес к исследованию различных белковых компонентов спермы, в том числе традиционно исследуемых в сыворотке крови. С этих позиций интерес представляет исследование индивидуальных белков семенной плазмы, выявление корреляционной связи их содержания в сперме с концентрацией, подвижностью и морфологическими особенностями сперматозоидов. Отмечено, что одной из причин снижения плодовитости мужчины является воспалительный процесс в предстательной железе и других органах репродуктивной системы (Agarwal A., Baskaran S., Parekh N., Cho C.L., Henkel R., Vij S., Arafa M., Panner Selvam M.K., Shah R. Male Infertility. Lancet. 2021; 397(10271): 319-333 doi: 10.1016/S0140-6736(20)32667-2). Поскольку предстательная железа является самой большой мужской добавочной железой, воспаление может ухудшать нормальную физиологию, а также непосредственно повреждать сперматозоиды после эякуляции, тем самым изменяя мужской потенциал фертильности.

Ведущим стимулятором синтеза белков острой фазы воспаления является фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α). Семейство ФНО-α представляет собой группу цитокинов, обладающих важными функциями при различных иммунных реакциях, в процессе воспаления, дифференцировки, контроля пролиферации различных клеток и их апоптоза. Данный белок рассматривается как ключевой цитокин, стимулирующий экспрессию необходимых для контроля воспаления и повреждения тканей генов. ФНО-α расценивают как основной провоспалительный медиатор, ответственный за активацию иммунной системы при инфекционных процессах. Бактериальные агенты и многие другие стимулы индуцируют синтез ФНО-α, который наряду с другими провоспалительными медиаторами активирует макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты в местах повреждения тканей и инфицирования. ФНО-α продуцируют, главным образом, такие клетки, как активированные макрофаги и лимфоциты, но, впоследствии, была найдена его экспрессия в эндотелиальных и эпителиальных клетках, в гладкомышечных клетках сосудов и в кардиомиоцитах. ФНО-α является компонентом как протеома сыворотки крови, так и протеома семенной плазмы.

Эякулят оценивают в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. - 5th ed. - WHO (Geneva), 2010. - Vol. 270); исследуют концентрацию и количество сперматозоидов, их подвижность и особенности морфологии. Объем эякулята (мл) определяют гравиметрически, рассчитывая разницу массы пустого контейнера и контейнера с материалом обследуемых. Вязкость образца оценивают по длине нити (мм), образующейся при извлечении стеклянной палочки из эякулята. Для подсчета концентрации и общего количества сперматозоидов, а также оценки их подвижности используют анализатор спермы (SQA-V, «MES», Израиль). При низкой концентрации сперматозоидов (менее 1 мл/мл) их подсчет проводят в камере Горяева.

Известен способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин, основанный на определении концентрации термостабильной карбоксилэстеразы в семенной плазме методом латексагглютинации (патент РФ №2697395). Анализ проводят в начале исследования и через 4-6 недель. По сумме концентраций двух определений выше 16,0 нг/мл прогнозируют идиопатическое бесплодие у мужчин. Недостатками указанного способа являются сложность и трудоемкость выполнения исследования, невозможность проведения в большинстве клинико-диагностических лабораторий из-за отсутствия необходимого оборудования, высокая стоимость исследования.

При мужском бесплодии более чем в 40% случаев отмечается наличие воспалительной реакции в органах мужской репродуктивной системы. Симптомы воспаления неспецифичны, в эякуляте выявляется лейкоцитоспермия (Eldamnhoury ЕМ, Elatrash GA, Rashwan НМ, El-Sakka AI. Association between leukocytospermia and semen interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in infertile men. Andrology. 2018 Sep; 6 (5):775-780. doi: 10.1111/andr.l2513). Однако отмечается сложность дифференцировки лейкоцитов с другими типами «круглых» клеток, которые могут быть представлены резидуальными тельцами и клетками сперматогенеза, что нередко приводит к неправильному подсчету количества лейкоцитов в сперме. Альтернативным способом регистрации воспалительного процесса в добавочных половых железах у мужчин является исследование состава белков семенной плазмы. Для определения концентрации различных белков в семенной плазме эякулята нередко используется полуколичественный метод, основанный на агглютинации латексного диагностикума (Литвинец Е.А., Кабиру А. Исследование уровня С-реактивного белка у больных хроническим бактериальным простатитом. Здоровье мужчины. 2018; 1: 85-87). Следует учитывать, что применение латексных диагностикумов может сопровождаться неспецифической агглютинаций при исследовании биологических материалов, характеризующихся повышенным содержанием слизи.

Способов, позволяющих точно и объективно прогнозировать инфертильность эякулята в изученных нами патентных источниках и научной медицинской литературе не обнаружено.

Задачей заявляемого решения является разработка критерия косвенной оценки качества сперматозоидов по уровню ФНО-α в эякуляте.

Мы предлагаем исследование ФНО-α в семенной плазме как маркера оценки тяжести воспалительной реакции в органах мужской репродуктивной системы, оценки плодовитости эякулята.

Технический результат: повышение точности прогнозирования инфертильности эякулята у мужчин за счет использования количественного критерия, основанного на результатах лабораторного исследования спермы; снижение трудоемкости выполнения, доступность для проведения исследования в условиях клинико-диагностических лабораторий.

Указанный результат достигается путем определения фактора некроза опухоли-альфа в эякуляте мужчины.

Способ осуществляют следующим образом: у обследуемого мужчины производится сбор эякулята после 2-4 дней полового воздержания. Семенную плазму отделяют путем центрифугирования образцов эякулята при 3000 об/минуту в течение 10 минут. Отделенную семенную плазму можно хранить 3 часа при комнатной температуре, до 12 часов при 4-8 градусах, и в течение длительного периода при -20 градусах и ниже. Концентрацию ФНО-α определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы «альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ» (А-8756), производства компании «Вектор-Бест» (Россия). Оптическую плотность проб регистрируют на вертикальном фотометре StatFax 3200 (Awareness, США). Необходимые реактивы: набор реагентов «альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ» (А-8756)», предназначен для количественного определения концентрации ФНО-α в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа, «Вектор-Бест», Россия.

Ход определения: процедура основана на принципах конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (конкурентной ELICA). Биотинилированный и небиотинилированный антиген конкурируют за ограниченное число связывающих мест специфических антител, иммобилизированных на твердой фазе. Количество биотинилированного антигена обратно пропорционально концентрации анализируемого вещества в образце. После установления равновесия и отмывания несвязанного антигена, оставшийся связанный антиген метят антителами к биотину, конъюгированными с белком, связывающим жирные кислоты. Затем его количество регистрируют фотометрически на длине волны 405 после проведения ферментативной реакции с Субстратом. Концентрацию антигена рассчитывают путем экстраполяции полученных данных на калибровочный график, построенный по результатам анализа с серией Стандартов, выражают в пг/мл (инструкция к набору для ИФА «альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ», «Вектор-Бест», Россия; артикул А-8756).

При значении ФНО-α выше 11,7 пг/мл прогнозируют инфертильность эякулята, то есть нарушение сперматогенеза, при значении ФНО-α от 0 до 11,7 пг/мл эякулят рассматривают как фертильный.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Пациент К., 28 лет. Жалоб не предъявляет. Брак 1-й, в браке 3 года. Частота половых сношений в паре три раза в неделю, половая жизнь регулярная, без применения контрацептивных средств. Случаев беременности в паре не зарегистрировано. Копулятивной дисфункции нет. В течение всей жизни к урологу не обращался, соматическими заболеваниями не болел. Жена обследована гинекологом - диагностирован эндометриоз, нарушена проходимость маточных труб. Из анамнеза жизни пациента: родился третьим ребенком в семье, рос и развивался соответственно возрасту. Перенесенные заболевания - болезнь Боткина; туберкулез, заболевания, передающиеся половым путем отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. Проведено 2 анализа эякулята с интервалом 6 месяцев. Результат спермограммы перед назначением семейной паре лечения: объем 3,4 мл; цвет серо-белый; вязкость 2 мм; количество сперматозоидов в 1 мл 62 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 210,8 млн. Живых - 67%. Подвижность: быстро прогрессивное движение -53%, 24% - непрогрессивное движение, 5% - малоподвижные, 18% -неподвижные. Морфология: 82% - нормальные формы, 8% - патология головки, 5% - патология шейки, 5% - патология хвоста. Лейкоциты - нет, рН 7,7. Заключение по анализу спермы: нормоспермия.

Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки - патологии не выявлено. Концентрация ФНО-α в эякуляте 8,2 пг/мл.

Диагноз: Бесплодие в браке.

По рекомендации гинеколога семейной паре было назначено лечение с применением вспомогательных репродуктивных технологий - экстракорпоральное оплодотворение спермой мужа. Через 3 месяца у партнерши наступила беременность.

Данный пример иллюстрирует связь концентрации ФНО-α ниже 11,7 пг/мл в сперме с отсутствием воспалительного процесса в добавочных мужских половых железах и фертильностью эякулята.

Пример 2. Пациент Т., 34 года обратился к андрологу с жалобой на отсутствие детей в браке. Беспокоит дискомфорт в области промежности при сидении, учащенное мочеиспускание, снижение выраженности эрекции при проведении полового акта. Брак 2-й, в браке 4 года. Половая жизнь в супружеской паре три раза в неделю, регулярная, без применения контрацептивов. При обследовании супруги гинекологом патологии не выявлено. Из анамнеза жизни пациента: родился вторым ребенком в семье, рос и развивался соответственно возрасту. Травм, операций не было. Эпидемический паротит, болезнь Боткина, туберкулез отрицает. Проходил лечение у венеролога по поводу гонорейного уретрита в возрасте 24 года. Профессиональных вредностей нет. Наружные половые органы - без патологии. При ректальном обследовании - предстательная железа увеличена в размерах, консистенция - уплотнена, безболезненна при пальпации, междолевая борозда сглажена; семенные пузырьки не пальпируются.

Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, органов мошонки - патологии нет. По данным трансректального ультразвукового исследования предстательной железы структура ткани неоднородная, очаговых образований не выявлено.

В сыворотке крови определяли содержание фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, пролактина, тестостерона, эстрадиола. Показатели в пределах нормы. Консультация уролога - патологии не выявлено. Консультация эндокринолога - эндокринная система без патологии.

В анализах эякулята (два исследования с интервалом в 5 мес) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед назначением лечения: объем 3,0 мл, цвет серо-белый, вязкость по тесту отрыва нити 10 мм. Количество сперматозоидов в 1 мл 38 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 114,0 млн. Живых - 76%. Подвижность: 5% - быстро прогрессивное движение, 5% - непрогрессивное движение, 70% - малоподвижные, 20% -неподвижные. Морфология: 40% - нормальные формы, 20% - патология головки, 35% - патология шейки, 5% - патология хвоста. Лейкоциты - единичные, рН 7,6. Заключение по анализу спермы: олигоастенозооспермия.

Концентрация ФНО-α в эякуляте 12,9 пг/мл.

Диагноз: Бесплодие в браке.

Больной проходил терапию в течение 1 года, у партнерши беременность не наступила.

Данный случай подтверждает соответствие показателя концентрации ФНО-α выше 11,7 пг/мл хроническому простатиту и инфертильности эякулята.

Пример 3. Пациент С., 37 лет. Жалобы на дискомфорт в области промежности, частые позывы на мочеиспускание, снижение выраженности эрекции. Брак 1-й, в браке девять лет. Частота половых сношений в паре два раза в неделю. Половая жизнь регулярная, частота половых сношений в паре два раза в неделю, контрацептивные средства не использовались. Случаев беременности в паре не зарегистрировано. Жена обследована гинекологом - патологии нет. Из анамнеза жизни пациента: родился первым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Из перенесенных заболеваний - в детстве часто ОРВИ, в течение последних 5 лет проходит лечение по поводу герпетической инфекции; эпидемический паротит, другие заболевания, передающиеся половым путем, болезнь Боткина, туберкулез отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет.

Проведено ректальное обследование - отмечается увеличение предстательной железы в размерах, плотной консистенции, при пальпации левой доли слегка болезненна при пальпации, правая безболезненна, междолевая борозда сглажена; семенные пузырьки не определяются. В анализах эякулята (всего сделано четыре в разное время) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед лечением пары: объем 3,0 мл, цвет серо-белый, консистенция - вязкая. Количество сперматозоидов в 1 мл 21 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 63 млн. Живых - 57%. Подвижность: быстро прогрессивное движение - не выявлено, 5% - непрогрессивное движение, 80% - малоподвижные, 15% - неподвижные. Морфология: 26% - нормальные формы, 40% - патология головки, 25% - патология шейки, 5% - патология хвоста, 4% - юные формы. Лейкоциты - единичные, рН 7,8. Заключение по анализу спермы: олигоастенозооспермия, тератоспермия.

Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки. Ультразвуковое исследование почек, органов мошонки - патологии не выявлено. По данным ультразвукового исследования предстательной железы отмечается неоднородность структуры ткани, очаговых образований не выявлено, остаточная моча 32 мл.

Определена концентрация фолликулостимулирующего гормона лютеинизирующего гормона, пролактина, тестостерона, эстрадиола в сыворотке крови. Результаты в норме. Консультация уролога - патологии не выявлено. Консультация эндокринолога - эндокринологических заболеваний не выявлено. Концентрация ФНО-α в эякуляте 13,4 пг/мл.

Диагноз: Хронический простатит. Бесплодие в браке.

Больной проходил терапию по поводу хронического простатита в течение 3 месяцев, показатели подвижности, концентрации и морфологии сперматозоидов оставались на том же уровне, что и в предыдущей спермограмме, концентрация; у партнерши беременность не наступила.

При повторном приеме отмечается положительная динамика - отсутствует дискомфорт в промежности, мочеиспускание стало реже - с частотой 1 раз в 3 часа. Содержание ФНО-α в сперме 11,9 пг/мл.

Больной продолжил лечение хронического простатита.

Через 2 месяца состояние пациента улучшилось, уровень концентрации ФНО-α в эякуляте снизился до 9,2 пг/мл. Увеличилось количество подвижных сперматозоидов в анализе эякулята (быстро прогрессивное движение - 35%, 40% - непрогрессивное движение, 15% - малоподвижные, 10% - неподвижные). У партнерши в супружеской паре диагностирована беременность, закончившаяся физиологическими родами.

Таким образом, способ обеспечивает точность прогнозирования инфертильности эякулята, повышает достоверность выявления мужского фактора бесплодия на доклинических стадиях, что позволяет в ранние сроки ставить на учет таких пациентов и проводить им своевременную адекватную терапию с целью улучшения результатов лечения бесплодия в супружеской паре.

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, репродуктологии, андрологии, лабораторной диагностике мужского фактора бесплодия, и может быть использовано для прогнозирования инфертильности эякулята у мужчин. В эякуляте мужчины методом твердофазного иммуноферментного анализа определяют концентрацию фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α). При значении ФНО-α выше 11,7 пг/мл прогнозируют инфертильность эякулята. При значении ФНО-α от 0 до 11,7 пг/мл эякулят рассматривают как фертильный. Способ обеспечивает снижение трудоемкости выполнения исследования, доступность в условиях клинико-диагностических лабораторий, повышение точности прогнозирования инфертильности эякулята у мужчин за счет использования количественного критерия, основанного на результатах лабораторного исследования спермы. 3 пр.

Способ прогнозирования инфертильности эякулята у мужчин с помощью лабораторных исследований, отличающийся тем, что в эякуляте мужчины методом твердофазного иммуноферментного анализа определяют концентрацию фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) и при значении ФНО-α выше 11,7 пг/мл прогнозируют инфертильность эякулята, то есть нарушение сперматогенеза, при значении ФНО-α от 0 до 11,7 пг/мл эякулят рассматривают как фертильный.