АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2006 года по МПК A61K31/7076 A61P29/00 

Настоящее изобретение относится к применению аденозин-5'-трифосфат-2',3'-диальдегида (оАТФ) для получения лекарственного средства, применяемого для лечения воспалительных заболеваний.

Молекула оАТФ образуется из АТФ окислением гидроксилов, присутствующих в рибозе в положениях 2' и 3' диальдегидов. Такое окисление может быть осуществлено солью перйодной кислоты, как описано у Р.N.Lowe et al., "Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds". Biochemical Society Transactions, Vol.7: 1131-1133, 1979.

Производное 2',3'-диальдегида АТФ обычно применяют в качестве маркера аффинности для ферментативных сайтов нуклеотидов (Eastcrbrook-Smith В., Wallace, J.C. & Keech, D.B. (1976) Eur. J. Biochem.62, 125-130), поскольку оно обладает способностью взаимодействовать с непротонированными остатками лизина, присутствующими в нуклеотидных сайтах, с образованием оснований Шиффа или дигидроморфолино производных (Colman, R.F. (1990) in The Enzymes - Sigman, D.S., and Boyer, P.D, eds - Vol.19, pp.283-323, Academic Press, San Diego). Молекула оАТФ также может быть использована для изучения активации тромбоцитов и ингибирования стимуляции скелетной мускулатуры цыпленка АТФ (Pearce, P.H., Wright, J.M. Egan C.M. & Scrutton, M.C. (1978) Eur. J. Biochem. 88, 543-554; Thomas, S.A., Zawisa, M.J., Lin, X. & Hume, R.I. (1991) Br. J. Pharmacol. 103, 1963-1969). Кроме того, исследования клеточных линий макрофагов доказали, что оАТФ способна блокировать эффект проницаемости плазматической мембраны, индуцированный АТФ, для снижения уровня гидролиза экзогенной АТФ мембранными экто-АТФазами и для ингибирования эффектов набухания, вакуолизации и клеточного лизиса, индуцируемых АТФ (Murgia et al. The Journal of Biological Chemistry, (1993) by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, inc., Vol 268, №11, pp.8199). Было высказано предположение, что оАТФ обладает антагонистической активностью в отношении P2z/P2X7 пуринорецепторов. IL-1β (интерлейкин 1β) ЛПС (= липополисахарид)-зависимое высвобождение из микроглиальных клеток, экспрессирующих P2z/P2X7, действительно селективно ингибируется оАТФ (Ferrari D. et al., J. Exp. Med., (1997) Vol.185, №3, Pag. 579-582).

Было обнаружено, что in vivo оАТФ оказывает значительное противовоспалительное и обезболивающее действие. В качестве экспериментальной модели было использовано одностороннее воспаление задних лапок крыс после инъекции в подошву стопы полного адъюванта Фрейнда (ПАФ). В качестве контроля брали лапку другой стороны у леченых животных, а также лапку не леченных. Воспаление, индуцированное ПАФ, наглядно проявлялось с 3 ч до 24-48 ч после инъекции увеличением объема лапки, гиперемией и повышенной болевой чувствительностью. Последнее было измерено альгезиометрическим тестом (тест нажатием на лапку), дающим возможность оценить пороговую величину болевой чувствительности. Инъекция оАТФ в подошву стопы значительно снижает болевую чувствительность (ноцицепцию), т.е. повышает пороговую величину болевой чувствительности. Различные дозы оАТФ во всех случаях индуцировали значительный, дозозависимый анальгезирующий эффект, длящийся приблизительно 12-24 часов, с максимальным действием уже через час после введения. Более того, на лапках крыс, обработанных оАТФ, уменьшилось проявление других признаков воспаления (распухание и гипертермия). В последующем тесте сравнения между оАТФ и диклофенаком - известным противовоспалительным лекарственным средством, применяемым при артритных патологиях, достоверно показано, что оАТФ оказывает значительно более высокое анальгезирующее действие, чем диклофенак. Тест, в котором крысам предварительно вводили фукоидин - ингибитор лейкоцитарного диапедеза - показал, что активность оАТФ не зависит от численности лейкоцитов в очаге воспаления. Уровни АТФ в очагах воспаления были значительно выше, чем у не леченных животных, что означает, что оАТФ может отчасти блокировать выработку экзогенного АТФ, таким образом предотвращая его провоспалительное действие.

Настоящее изобретение относится к применению оАТФ в качестве лекарственного средства для лечения воспаления и состояний, сопровождающихся болью. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим оАТФ в качестве активного ингредиента, вместе с фармацевтически приемлемыми наполнителями. Формы, подходящие для перорального, наружного или парентерального введения, представляют собой, например, таблетки, шарики, покрытые сахаром, капсулы, гранулы, порошки, суппозитории, сиропы, растворы, суспензии, кремы, мази, гели, пасты, лосьоны, эмульсии, спреи. Фармацевтические композиции могут быть получены в соответствии со способом, описанным в Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., NY. USA, XVII Ed. Количество активного вещества в единичной дозе может находиться в интервале от 0,05 до 100 мг на кг массы тела, для однократного или многократного введения в день, в зависимости от тяжести заболевания, подлежащего лечению, и состояния пациента. Дневная доза обычно составляет от 1 до 300 мг, предпочтительно от 10 до 100 мг.

Соединение по данному изобретению также может быть использовано в комбинации с другими, обычно используемыми, противовоспалительными лекарственными средствами.

Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1: фармакологическая активность оАТФ

Индукция воспаления у крыс.

Были использованы самцы инбредных крыс Фишер (Charies River Italy, Caico, Lecco, Italy) весом около 250 г. Под действием кратковременной анастезии изофлураном крысам проводили внутриподошвенную инъекцию полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) в правую заднюю лапу (0,15 мл). Эта инъекция вызывала односторонее воспаление (от 3 ч до 24-48 ч после инъекции), проявляющееся в увеличении объема лапки, гипертермии и повышенной болевой чувствительности. Повышенную болевую чувствительность оценивали альгезиометрическим тестом с использованием альгезиометра (Ugo Basile, Comerio, Italy) для определения пороговой величины давления, выраженной в граммах, а именно давления, при котором происходит отдергивание лапы, показывающее пороговый уровень болевой чувствительности. Для каждого теста использовали от 6 до 8 крыс. Во время проведения этих испытаний с животными обращались в соответствии со "стандартными этическими принципами" (NIH, 1985).

Лечение оАТФ

Через 24 ч после инъекции ПАФ получали воспаленную лапку крысы, проводили внутриподошвенную инъекцию различных доз оАТФ (от 56 до 336 мкМ), считая нулевой отметкой времени момент введения оАТФ. Полученные уровни пороговой величины болевой чувствительности представлены в Таблице 1.

ТАБЛИЦА 1ПОРОГОВАЯ ВЕЛИЧИНА БОЛЕВОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИЛИ "ПОРОГОВОЕ ДАВЛЕНИЕ НА ЛАПУ" ОАТФ 56 мкМ112 мкМ224 мкМ336 мкМ0 мин60±1,665±2,050±1,560±1,930 мин120±2,1*140±3,5*350±5,4*300±3,4*60 мин190±2,3*180±4,2*400±10,3*≥750 *190 мин85±2,5*150±3,8*300±11,2*≥750 *2120 мин75±1,8*100±3,0*185±7,1*600±20,8*240 мин75±2,6*105±4,3*180±8,9*550±18,4**1,2 = исключеныДанные представлены как среднее значение ± ср.кв.ош. порогового давления на лапу (умеренное в г) р<0,05 в сравнении с 0 моментом времени (воспаленная лапка, без лечения)
* Тест Mann-Whitney

Сходные результаты были получены при использовании 35 мкм оАТФ вместо 56 мкм оАТФ 56 или при воспалении, вызываемом (инъекцией ПАФ) в течение 6 или 12 ч вместо 24 ч. Кроме того, лапки, которые лечили оАТФ были менее болезненны, а также в них были снижены признаки воспаления (распухание, гиперемия) по сравнению с не леченными лапками.

Был доказан дозозависимый эффект оАТФ, хотя значимо высокие результаты были достигнуты уже при минимальной используемой дозе. Однако более низкие дозы имели менее продолжительное по времени анальгезирующее действие, возможно из-за неполного насыщения Р2Х7 рецепторов.

В последующей серии экспериментов было исследовано действие максимальных используемых доз оАТФ в течение более длительных промежутков времени, на лапках крыс, у которых воспаление вызывали за 48 часов (таблица 2). Эти данные подтверждают то, что инъекция оАТФ значительно повышает пороговые уровни болевой чувствительности в течение весьма длительного времени, хотя наблюдается прогрессирующее снижение действия в течение времени.

ТАБЛИЦА 2ПОРОГОВАЯ ВЕЛИЧИНА БОЛЕВОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИЛИ "ПОРОГОВОЕ ДАВЛЕНИЕ НА ЛАПУ" ОАТФ 336 мкМ0 мин55±2,030 мин210±10,760 мин360±25,890 мин395±30,2120 мин450±38,1180 мин550±45,9240 мин690±56,612 часов400±29,724 часа210+7,226 часов190+3,3

Пороговые величины болевой чувствительности лапок в контроле (как невоспаленные лапки другой стороны, так и лапки без лечения) составили приблизительно 100-150, выраженные как порог болевой чувствительности или пороговое давление на лапу, измеренные в г.

Внутриподошвенная инъекция АТФ (0,9 ммоль) (внеклеточный АТФ является цитолитическим и поэтому, возможно, обладает способностью инициировать сигналы болевой чувствительности) вызывала снижение пороговой величины болевой чувствительности значительно больше в невоспаленных лапках, чем в воспаленных лапках (значения с 120±3,2 до 25±3,0 установлены в невоспаленных лапках, 240 мин после внутриподошвенной инъекции АТФ), по сравнению со снижением с 65±4,2 до 50±4,1 в воспаленных лапках. Эти результаты, возможно, указывают на то, что цитолитический АТФ уже присутствует в более высоких количествах в воспаленных лапках, чем в невоспаленных. С другой стороны, оАТФ был эффективен в повышении пороговой величины болевой чувствительности в течение короткого времени также в невоспаленных лапках, будучи эффективным уже в самой низкой концентрации оАТФ (=56 мкМ). Кривые доза/эффект в невоспаленных лапках в действительности накладывались (до 120 мин после введения оАТФ) при использовании различных концентраций молекулы. Чтобы установить, было ли анальгезирующее действие оАТФ связано с активацией воспалительных клеток, способных продуцировать эндогенные β-эндорфины, некоторым крысам внутривенно вводили фукоидин (10 мк/кг). Действительно, фукоидин ингибирует лейкоцитарный диапедез и скопление лейкоцитов в месте воспаления. Проводили предварительную обработку фукоидином обеих лапок за 30 мин до инъекции в одну из них ПАФ. Пороговое давление болевой чувствительности (ПДБ) измеряли как в невоспаленных, так и в воспаленных лапках, до и после введения оАТФ (224 мкм).

Полученные результаты представлены графически на Фиг.1. Инъекция оАТФ значительно не изменяла уровни ПДБ в невоспаленных лапках, тогда как лечение воспаленных лапок оАТФ восстанавливало уровни ПДБ, которые были сильно снижены инъекцией провоспалительного ПАФ. Таким образом, анальгезирующее действие оАТФ зависело от увеличения численности лейкоцитов.

В заключение, обезболивающее действие оАТФ сравнили с диклофенаком - известным противовоспалительным и анальгезирующим лекарственным средством. После определения нижнего порога болевой чувствительности у крыс вызывали одностороннее воспаление задней лапки инъекцией ПАФ. Через 3 часа после инъекции животных разделили на 2 группы, одну из которых местно обрабатывали оАТФ (336 мкМ), а другую диклофенаком (15 мг). Анальгезирующее действие оАТФ было значительно выше, чем у диклофенака (результаты стандартного эксперимента приведены на Фиг.2). Концентрации оАТФ и диклофенака были выбраны так, чтобы обеспечить хорошее растворение молекулы в стерильном физиологическом растворе перед введением в подошву стопы крыс.

Наконец, внутривенное введение оАТФ крысам при исследуемых для внутриподошвенного введения дозах вызвало дозозависимое ослабление боли приблизительно в течение двух часов, хотя рефлексы до сих пор явно присутствовали.

Содержание АТФ определяли в лапках крыс, обработанных оАТФ, и в не леченных лапках другой стороны. У воспаленных и невоспаленных лапок удаляли подкожные ткани и быстро замораживали в жидком азоте. Замороженные образцы ткани взвешивали, гомогенизировали в фосфатном буфере, затем обрабатывали К₂СО₃ и нейтрализовали и центрифугировали в конце. Супернатант использовали для анализа АТФ люминесцентным методом.

Величины АТФ были значительно выше в гомогенатах, полученных из необработанных лапок, чем в обработанных оАТФ (1050±90 нмоль/г свежей ткани у необработанных животных по сравнению с 320±22 нмоль/г свежей ткани животных, обработанных оАТФ - каждая величина является средним значением ± ср.кв.ош. 7 экспериментов). Это указывает на то, что оАТФ блокирует образование экзогенного АТФ той же тканевой структурой, связываясь с их мембранными рецепторами, таким образом уменьшая повреждения, вызываемые экзогенным АТФ.

Пример 2: изменение содержания АТФ в периферических подкожных тканях после обработки оАТФ

Исследование содержания АТФ в лапках крыс.

Устанавливали в отдельных группах крыс изменения содержания АТФ, вызванные процессом воспаления в ткани подошвы и/или воздействием оАТФ. В установленное время удаляли подкожные ткани лапок и быстро замораживали в жидком азоте для блокирования любой метаболической активности. Замороженную ткань гомогенизировали с политроном (Kinematica GmbH, Luzern, Switzerland) в охлажденном на льду 6% (мас./объем) HClO₄ для экстракции нуклеотидов. Гомогенат центрифугировали и супернатант использовали для определения АТФ по ранее описанной методике (Marni et al. Transplantation (1988), 46: 830-835). Анализ АТФ проводили люминесцентным методом (Ferrero et al., Res Commun Chem Path Pharmac 1984; 45: 55-67).

Результаты

Измеряли уровни АТФ в воспаленных (24-часовой обработкой ПАФ) и невоспаленных лапках, обработанных оАТФ, в 6 и 12 часов после введения оАТФ, и в необработанных лапках другой стороны. Как показано на Фиг.3, в невоспаленных тканях, обработанных оАТФ, уровни АТФ значительно не изменились: данные могли отразить внутриклеточные уровни метаболита, который значительно не изменен обработкой оАТФ. Напротив, уровни АТФ в воспаленных тканях, которые значительно выше, чем в невоспаленных тканях, были значительно снижены обработкой оАТФ. Действительно, высвобождение АТФ (внеклеточного АТФ) из клеток требует их повреждения и происходит при воспалении или других дегенеративных процессах. Связывание АТФ с рецепторами, расположенными на многих клетках и также на чувствительных нервных окончаниях, могло конкурентно блокировать связывание внеклеточного АТФ с теми же структурами, таким образом ограничивая связанную с АТФ цитотоксичность и вызывая ослабление боли. Наши результаты указывают также на то, что обработка воспаленных тканей оАТФ ограничивает дальнейшее продуцирование АТФ воспалительным или другими клетками, возможно блокируя их активацию.

Фиг.3: влияние на уровни АТФ инъекций оАТФ в подошву воспаленных или невоспаленных лапок.

Содержание АТФ в 6 и 12 часов после инъекции оАТФ (35 мкМ) в подошву лапок крыс: воспаленные (24 часовым введением ПАФ) (черные столбцы), воспаленные обработанные оАТФ (заштрихованные столбцы), невоспаленные (не заштрихованные столбцы), невоспаленные обработанные оАТФ (столбцы с горизонтальными линиями), *р<0,005 сравнивали с воспаленными необработанными лапками, тест Вилксона. Данные представлены как средние значения ± ср.кв.ош. 7 экспериментов.

Изобретение относится к применению аденозин-5'-трифосфата-2'3'-диальдегида для получения анальгетического лекарственного средства. 2 табл., 3 ил.

Применение аденозин-5'-трифосфата-2'3'-диальдегида для получения анальгетического лекарственного средства.