СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ТЕЧЕНИЯ ХЛАМИДИЙНОГО КОНЪЮНКТИВИТА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано с целью дифференциальной диагностики острой и хронической формы течения хламидийного конъюнктивита.

Хламидийные конъюнктивиты (ХК) составляют значительную долю всех конъюнктивитов, и, как правило, характеризуются длительным рецидивирующим течением и устойчивостью к проводимой терапии. Учитывая, что распространенность хламидийных поражений глаз в последнее время имеет тенденцию к росту, проблема поиска эффективного метода диагностики с целью уточнения стадии заболевания имеет большое значение в отношении выбора тактики лечения.

Известен способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза, включающий изучение реакции лейкоцитов макроорганизма на присутствие инфекционного агента путем исследования спонтанной и стимулированной зимозаном хемилюминесценции лейкоцитов, где в качестве индуктора используют лизат элементарных телец хламидий. При индексе хемилюминесценции по зимозану (ИХЛ-з) 21,35≅ИХЛ-з≅31,41 и специфическому антигену (ИХЛ-аг) 0,53≅ИХЛ-аг≅1,00 диагностируют хроническую хламидийную инфекцию, а при ИХЛ-з<21,35 и ИХЛ-аг>1,00 диагностируют острую стадию заболевания (Прохоренков В.И., Шапран М.В., Тюкавкин В.В. Патент РФ №2000109432, 2002). Недостатком способа является трудоемкость методики и использование дорогостоящего оборудования (хемилюминометр).

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ определения клинической формы хламидийного заболевания, основанный на серологическом методе исследования крови (IgG, IgA, IgM) посредством иммуноферментного анализа (ИФА). При титре IgG>100-6400, IgA>50-1600 и IgM>50-3200 выставляют острую стадию заболевания, а при титре IgG>50-200, a IgA>100-1600 - хроническую (Мальханов В.Б., Гумерова Е.И., Шевчук Н.Е., Значение диагностических лабораторных исследований при офтальмоинфекциях и паразитарных заболеваниях глаз, Уфа, 2001). Однако, как отмечают сами авторы, чувствительность метода колеблется от 65 до 70%.

Технический результат - назначение патогенетически обоснованной терапии, оптимизирующий прием антибактериальных средств по дозе, длительности и виду, с целью предупреждения перехода ХК в антибиотикорезистентную форму непрерывно рецидивирующего характера и развития осложнений со стороны глазного яблока.

Технический результат достигается способом дифференциальной диагностики острой и хронической формы течения хламидийного конъюнктивита путем исследования сыворотки крови пациентов, отличающийся тем, что определяют суммарный уровень конечных метаболитов оксида азота (NO₂ ^-/NO₃ ^-) и при концентрации NO₂ ^-/NO₃ ^- в сыворотке крови выше 50 мкмоль/л течение заболевания оценивают как острое, а при концентрации NO₂ ^-/NO₃ ^- в сыворотке крови ниже 50 мкмоль/л - как хроническое.

Содержание NO₂ ^-/NO₃ ^- в сыворотке крови определяют по модифицированной методике Schmidt H.H.H.W., Kelm M. (Methods in Nitric Oxide Research. Ed. by M.Feelisch and J.S.Stamler. 1996, John Wiley and Sons Ltd. P.491-497).

Способ осуществляют следующим образом.

Для определения общего содержания NO₂ ^-/NO₃ ^- в крови получают сыворотку путем центрифугирования образца в пробирке при 200g (1500 об/мин, центрифуга ОПН-3) в течение 10 мин. Отбирают 1 мл сыворотки в другую пробирку и депротеинизируют путем двухэтапного осаждения белков центрифугированием при ˜6000g (8000 об/мин, центрифуга ОПН-8) при добавлении к ней на первом этапе 1,8 мл 96% спирта, а на втором - 0,2 мл 15% сульфата цинка. После этого 1 мл супернатата переносят в следующую пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, 1 мл глицинового буфера (рН=9,7), всыпают 8 г кадмиевых гранул, активированных в 5 mM сульфате меди в течение 5 мин, и инкубируют при t=20-22°C в течение 60 мин. Затем переносят 3 мл смеси в другую пробирку и добавляют 0,6 мл 17,5 mM сульфаниламида в 6 М соляной кислоте и инкубируют при t=0-4°C (на ледяной подушке) 25 мин. После этого добавляют 0,2 мл 20,0 mM N-(1-нафтил)-этилендиамина и инкубируют при t=22°C в течение 20 мин. На завершающем этапе определяют оптическую плотность на спектрофотометре (фотоэлектроколориметре) в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 540 нм против кюветы, содержащей 3,6 мл дистиллированной воды и 0,2 мл 20,0 mM N-(1-нафтил)-этилендиамина. Расчет концентрации проводят по калибровочному графику для нитрата калия и умножают на коэффициент разведения (k=3). Полученную концентрацию NO₂ ^-/NO₃ ^- выражают в мкмоль/л.

Нормальные значения NO₂ ^-/NO₃ ^- сыворотки крови, установленные у 10 клинически здоровых доноров в возрасте от 24 до 56 лет вышеописанным методом, составляют 41,5±5,9 мкмоль/л.

Проведенные клинико-лабораторные исследования позволили установить диапазоны концентрации NO₂ ^-/NO₃ ^- в сыворотке, соответствующие острой и хронической формам ХК.

Так, концентрация NO₂ ^-/NO₃ ^- сыворотки крови, превышающая 50 мкмоль/л, соответствует острой форме течения ХК (длительность заболевания менее 1 мес.). При концентрации NO₂ ^-/NO₃ ^- меньше 50 мкмоль/л выставляют хроническую форму ХК (длительность заболевания больше 1 мес.).

Приводим подробные клинические примеры для каждой формы течения ХК.

Пример 1. Больной К., 28 лет (и.б. №30-0533 за 2004 г.) поступил на стационарное лечение в УфНИИГБ на 5 сутки с начала клинических проявлений ХК с жалобами на слезотечение и покраснение левого глаза. При объективном осмотре: OD - Конъюнктива бледно-розовая, оптические среды прозрачные. С глазного дна розовый рефлекс. Острота зрения 1,0; OS - глазная щель несколько сужена, веки слегка отечны, из конъюнктивальной полости слизисто-гнойное отделяемое в умеренном количестве, конъюнктива век гиперемирована, на нижнем своде множественные сосочки, небольшой отек роговицы в поверхностных слоях, глубжележащие отделы глаза без патологических изменений. Острота зрения 1,0. Методом флуоресцирующих антител определялось свечение антигена C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS в значительном количестве клеток. ПЦР анализ подтвердил наличие C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS. Содержание NO₂ ^-/NO₃ ^- сыворотки крови на 7 день заболевания составило 50,89 мкмоль/л. Выставлен клинический диагноз: OS: Острый ХК, папиллярная форма, эпителиальный кератит. В данном случае острая форма клинического течения ХК установлена на основании значения NO₂ ^-/NO₃ ^- больше 50 мкмоль/л. Последующий характер клинического течения - выздоровление на 21 день, отсутствие рецидивов, а также данные ИФА сыворотки крови на антитела к C.trachomatis это подтвердили. Титр антител, выявляемый иммуноферментным анализом, соответствовал для IgG 50, IgA 200; IgM 800.

Пример 2. Больной С., 29 лет (амб. карта №0173-04, 2004 г.) поступил на амбулаторное лечение в УфНИИГБ на 7 сутки с начала клинических проявлений ХК с жалобами на слезотечение, чувство инородного тела и покраснение правого глаза. При объективном осмотре: OD - глазная щель умеренно сужена, веки отечные, из конъюнктивальной полости слизисто-гнойное отделяемое в значительном количестве, конъюнктива век гиперемирована (больше нижнее), на нижнем своде множественные сосочки, небольшой отек роговицы в поверхностных слоях, глубжележащие отделы глаза без патологических изменений. Острота зрения 0,8 (не корригирует). OS - Конъюнктива бледно-розовая, оптические среды прозрачные. С глазного дна розовый рефлекс. Острота зрения 1,0. Методом флуоресцирующих антител определялось свечение антигена C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS в значительном количестве клеток. ПЦР анализ подтвердил наличие C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS. Содержание NO₂ ^-/NO₃ ^- сыворотки крови на 8 день заболевания составило 85,10 мкмоль/л. Титр антител, выявляемый иммуноферментным анализом, соответствовал для IgG 25, IgA 50; IgM 50. Выставлен клинический диагноз: OD: Острый ХК, папиллярная форма, эпителиальный кератит. Острая форма течения ХК установлена на основании значения NO₂ ^-/NO₃ ^- более 50 мкмоль/л. Данные иммуноферментного анализа сыворотки крови, установившиеся концентрации иммуноглобулинов трех классов А, М и G к C.trachomatis, не позволили дифференцировать у больного острую или хроническую форму ХК.

Пример 3. Больная С., 47 лет (и.б. №30-6392 за 2003 г.) поступила на стационарное лечение в УфНИИГБ с жалобами на периодически возникающее чувство жжения в обоих глазах в последние 5 лет. При объективном осмотре: OU - Конъюнктива век умеренно гиперемирована, слегка отечна, инфильтрирована, переходные складки век валикообразно утолщены, в конъюнктивальной полости слизисто-гнойное отделяемое в небольшом количестве, оптические среды прозрачные. С глазного дна розовый рефлекс. Острота зрения OU: 0,7 с корр. +1,5Д=1,0. Методом флуоресцирующих антител определялось свечение антигена C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS в небольшом количестве клеток, OD - не определялось. ПЦР анализ подтвердил наличие C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OU. Содержание NO₂ ^-/NO₃ ^- сыворотки крови на 2 день стационарного обследования составило 37,77 мкмоль/л. Выставлен клинический диагноз: OU: Хронический ХК, инфильтративная форма. В данном случае хроническое течение заболевания установлено на основе небольших значений (менее 50 мкмоль/л) содержания NO₂ ^-/NO₃ ^-, что совпало с рецидивирующим характером течения заболевания и данными ИФА титра специфических антител против хламидий (IgG 100, IgA 200).

Заявленным способом обследовано 19 больных ХК, у которых острое или хроническое течение ХК установлено на основании концентрации NO₂ ^-/NO₃ ^- в сыворотке крови. При этом у 5 больных ХК носил острое, а у 14 - хроническое течение. У 15 больных ХК заявленная концентрация NO₂ ^-/NO₃ ^- в сыворотке крови совпадала с клиническим течением (4 - с острым ХК, 11 - с хроническим ХК), что составило 79%. У 4 больных концентрация NO₂ ^-/NO₃ ^- в сыворотке крови не соответствовала клиническому течению ХК (1 - с острым ХК, 3 - с хроническим ХК), что составило 21%. Следовательно, клиническая форма течения ХК на основании показателей содержания NO₂ ^-/NO₃ ^- в сыворотке крови, может быть определена с точностью 79%.

Таким образом, использование данного способа диагностики клинической формы течения ХК дает возможность обоснованно назначить патогенетически ориентированную терапию. Предложенный способ отличается более высокой информативностью результатов (79%), чем ИФА (65-70%), а с учетом его относительной простоты и хорошей воспроизводимости может быть применен в лечебных учреждениях, имеющих биохимическую лабораторию, поэтому способ является доступным, а следовательно, "практически применимым".

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии Определяют суммарный уровень конечных метаболитов оксида азота (NO₂ ^-/NO₃ ^-) в сыворотке крови больных хламидийным конъюнктивитом. При концентрации NO₂ ^-/NO₃ ^- выше 50 мкмоль/л диагностируют острую форму хламидийного конъюнктивита. Способ обеспечивает хорошую воспроизводимость.

Способ диагностики острого течения хламидийного конъюнктивита путем исследования сыворотки крови пациентов, отличающийся тем, что определяют суммарный уровень конечных метаболитов оксида азота (NO₂ ^-/NO₃ ^-) и при концентрации его в сыворотке крови выше 50 мкмоль/л течение заболевания оценивают как острое.