СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗОВ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается диагностики хламидиозов с помощью реакции специфического лейкоцитолиза (РСЛ).

Хламидийная инфекция по распространенности и поражаемому контингенту выходит в настоящее время на одно из первых мест среди других инфекционных заболеваний. Однако клиническая диагностика ее затруднена тем, что около 70% случаев хламидиозов протекают бессимптомно, а если признаки болезни и наблюдаются, то они не носят специфического характера. Поэтому решающее значение для правильной постановки диагноза имеет лабораторная диагностика хламидийной инфекции.

Основные диагностические тесты направлены на выявление хламидий или их антигенов в клиническом материале от больных. К ним относятся культуральный метод, прямой вариант метода флуоресцирующих антител, полимеразная и лигазная цепные реакции (Лозняк А.Л. и др. // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 2002. - №5. - С.46-53).

По мнению многочисленных исследователей, диагностика хламидиозов требует применения комплекса лабораторных методов, позволяющих обнаруживать как антигены хламидий, так и антитела к ним (Скрипкин Ю.К. и др. // Вестн. Дерматол. Венерол. - 1996. - №4. - С.26-29).

Наиболее близким аналогом, предлагаемому способу является иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения антител к хламидиям в сыворотке крови больных, который предусматривает инкубацию ее при 37°С в лунке стрипа с сорбированным антигеном, отмывку промывающим раствором, последовательную обработку рабочим разведением пероксидазного конъюгата и ортофенилендиамином, добавление стоп-реагента и измерение оптической плотности при длине волны 492 нм (Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин B.C. Иммуноферментный анализ в микробиологии // Саратов: Изд-во Саратовск. Университета, 1990. - 112 с.).

Известно, что хламидии являются слабоиммуногенными микроорганизмами и вызывают замедленный низкий гуморальный иммунный ответ. Для его оценки необходимо исследование парных сывороток. В то же время считается, что реакции клеточного иммунитета более чувствительны к воздействию чужеродных антигенов, и с их помощью можно выявлять характерные изменения, начиная со 2-го дня от начала болезни.

Целью изобретения является выявление ответа клеточного иммунитета на хламидийную инфекцию в ранние сроки заболевания.

Поставленная цель достигается тем, что гепаринизированную кровь смешивают с хламидийным антигеном, подсчитывают в ней количество лейкоцитов, инкубируют при 37°С, через 2 ч вновь определяют количество лейкоцитов и рассчитывают показатель разрушения лейкоцитов (ПРЛ) по формуле.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Пример 1. Постановка РСЛ у пациента с циститом бактериальной этиологии.

Больной М. обратился в медицинское учреждение по поводу цистита. Для установления хламидийной этиологии заболевания ему была выполнена РСЛ. Стерильным шприцем у больного взяли 1 мл крови из локтевой вены и поместили ее в пробирку с 0,1 мл раствора гепарина (5 ЕД/мл крови). Затем по 0,1 мл гепаринизированной крови внесли в 2 пробирки. В 1-ю (опытную) добавили 0,1 мл хламидийного антигена, в качестве которого использовали коммерческий диагностикум для РИГА и РСК, полученный из желточных мешков, инфицированных культурой хламидии. Во 2-ю пробирку вносили 0,1 мл забуференного физиологического раствора рН 7,2-7,4 (контроль). Каждую пробирку встряхивали по 20 сек. Содержимое пробирок набирали в меланжеры до метки 0,5 и далее - 3% уксусную кислоту до метки 11. Меланжеры клали горизонтально. Пробирки помещали в термостат при 37°С на 2 ч. Меланжеры встряхивали 2 мин, первые 3 капли удаляли, заполняли счетную камеру Горяева и устанавливали ее на предметном столике микроскопа. Для определения количества лейкоцитов в 1 мкл реакционной смеси в опытной и контрольных пробах подсчитывали их число в 100 больших квадратах по всей сетке и умножали на 50. Через 2 часа инкубирования пробирки извлекали из термостата и вновь подсчитывали в содержимом из них количество лейкоцитов с помощью меланжеров и камеры Горяева.

Реакцию оценивали по показателю разрушения лейкоцитов (ПРЛ), который рассчитывали по формуле:

где

L₀₁ - количество лейкоцитов в опытной пробирке до инкубации

L₀₂ - количество лейкоцитов в опытной пробирке после инкубациии

L_K1 - количество лейкоцитов в контрольной пробирке до инкубациии

L_K2 - количество лейкоцитов в контрольной пробирке после инкубациии,

и при величине ПРЛ, большей или равной 0,2 диагностируют хламйдиоз.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Пример расчета:

Таблица 1ПробиркиДо инкубацииПосле инкубацииОпытная40003900Контрольная40003900L₀₁ – 4000ПРЛ=0,2L₀₂ - 3900L_K1 - 4000L_K2 - 3900

Величина ПРЛ оказалась меньше значения 0,2, следовательно, у больного хламидийная инфекция отсутствует. При исследовании мочи и соскобов из уретры больного М. прямым методом флуоресцирующих антител антигены хламидий не обнаружены.

Пример 2. Постановка РСЛ у больной негонококковым уретритом.

Больной З. Для выяснения причины негонококкового уретрита провели РСЛ. Техника постановки реакции подробно описана в примере 1. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2ПробиркиДо инкубацииПосле инкубацииОпытная42002500Контрольная43004200L₀₁ – 4200ПРЛ=0,4L₀₂ - 2500L_K1 - 4300L_K2 - 4200

Значение ПРЛ превышало величину 0,2, поэтому у больной имеются антигены хламидий. Методом флуоресцирующих антител подтверждено присутствие хламидий (C.trachomatis) в соскобах из мочеиспускательного канала.

Пример 3. Постановка РСЛ у больного хроническим рецидивирующим бронхитом.

Больной С. обратился за медицинской помощью по поводу хронического рецидивирующего бронхита. Кровь пациента исследовали с помощью РСЛ, как описано в примере 1.

Результаты обследования представлены в таблице 3.

Таблица 3ПробиркиДо инкубацииПосле инкубацииОпытная34001600Контрольная34003300L₀₁ – 3400ПРЛ=0,55L₀₂ - 1600L_K1 - 3400L_K2 - 3300

Величина ПРЛ превысила 0,2, поэтому считали, что у больного имеется хламидийная инфекция. При исследовании мокроты и мазка из зева методом флуоресцирующих антител у больного С.выявлены антигены C.pneumoniae.

Пример 4. Постановка РСЛ у больного хроническим рецидивирующим простатитом.

Больной П. обратился за медицинской помощью по поводу хронического рецидивирующего простатита. Кровь пациента исследовали с помощью РСЛ, как описано в примере 1.

Результаты обследования представлены в таблице 4.

Таблица 4ПробиркиДо инкубацииПосле инкубацииОпытная34001400Контрольная34003200L₀₁ – 3400ПРЛ=0,6L₀₂ - 1400L_K1 - 3400L_K2 - 3200

Величина ПРЛ превысила 0,2, поэтому считаем, что у больного имеется хламидийная инфекция. При исследовании сока простаты методом флуоресцирующих антител у больного П. выявлены антигены C.trachomatis.

Пример 5. Постановка РСЛ у больного хроническим рецидивирующим конъюнктивитом.

Больной К. обратился за медицинской помощью по поводу хронического рецидивирующего конъюнктивита. Кровь пациента исследовали с помощью РСЛ, как описано в примере 1.

Результаты обследования представлены в таблице 5.

Таблица 5ПробиркиДо инкубацииПосле инкубацииОпытная25001500Контрольная25002400L₀₁ – 2500ПРЛ=0,4L₀₂ - 1500L_K1 - 2500L_K2 - 2400

Величина ПРЛ превысила 0,2, указывающая, что у больного имеется хламидийная инфекция. При исследовании мазка с конъюнктивы методом флуоресцирующих антител у больного К. выявлены антигены C.trachomatis.

Таким образом, стало возможным выполнять диагностику хламидиоза в ранние сроки заболевания по величине ПРЛ.

Предлагаемый способ диагностики хламидиозов прост, доступен, не трудоемок, не требует повторного исследования крови больного и позволяет выявлять наличие хламидийной инфекции.

Рекомендуется использовать как дополнительный тест в комплексной диагностике хламидиозов.

Изобретение относится к области микробиологии и касается диагностики хламидиозов с помощью реакции специфического лейкоцитолиза. Сущность изобретения состоит в том, что гепаринизированную кровь смешивают с хламидийным антигенным диагностикумом в опытной пробирке с физиологическим раствором в контрольной пробирке, подсчитывают количество лейкоцитов, инкубируют, через 2 часа повторно подсчитывают количество лейкоцитов и расчитывают показатель разрушения лейкоцитов (ПРЛ) и при величине ПРЛ большей или равной 0,2 диагностируют хламидиоз. Техническим результатом является диагностика хламидиоза в более ранние сроки. 5 табл.

Способ диагностики хламидиозов путем исследования крови больного, отличающийся тем, что 0,1 мл гепаринизированной крови смешивают с 0,1 мл хламидийного антигенного диагностикума в опытной пробирке с 0,1 мл физиологического раствора в контрольной пробирке, подсчитывают количество лейкоцитов, инкубируют в термостате при 37°С, через 2 ч повторно подсчитывают количество лейкоцитов и расчитывают показатель разрушения лейкоцитов (ПРЛ) по формуле:

где

L₀₁ - количество лейкоцитов в опытной пробирке до инкубации;

L₀₂ - количество лейкоцитов в опытной пробирке после инкубации;

L_K1 - количество лейкоцитов в контрольной пробирке до инкубации;

L_K2 - количество лейкоцитов в контрольной пробирке после инкубации,

и при величине ПРЛ, большей или равной 0,2, диагностируют хламидиоз.