СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/49 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к разработке способов диагностики лейкоза крупного рогатого скота (КРС).

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, протекающая бессимптомно или проявляющаяся лимфоцитозом и злокачественными образованиями в кроветворных и других органах и тканях. Возникновение и развитие болезни обусловлено вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), который является ретровирусом, имеющим организацию, сходную с Т-лимфотропными вирусоми человека и обезьян.

Официальная регистрация этой болезни проводится с 1965 года. В настоящее время лейкоз крупного рогатого скота распространен во всех субъектах Российской Федерации. Начиная с 1991 года, эпизоотическая обстановка по лейкозу непрерывно осложняется, несмотря на значительное сокращение поголовья крупного рогатого скота в стране. С 1997 г. эта болезнь прочно занимает первое место в структуре инфекционной патологии. В 2000 г. на лейкоз пришлось 39,67% всех случаев инфекционных болезней, выявленных у крупного рогатого скота, а в 2001 г. - 53,7%. По состоянию на 01.01.2001 г. в стране зарегистрировано 2707 пунктов, неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота. При этом необходимо отметить, что за последние годы число неблагополучных пунктов увеличивается. Ежегодно в стране болеет лейкозом более 40 тыс. животных (1).

Основной принцип искоренения лейкоза базируется на элиминации зараженных ВЛКРС животных из стад. Поэтому развитие способов детекции ВЛКРС является решающим фактором в борьбе с этим заболеванием. Способы выявления животных, инфицированных ВЛКРС, можно разделить на две группы:

1) омплекс серологических реакций, позволяющих выявлять специфические антитела против антигенов вируса лейкоза;

2) пособы обнаружения вируса или экспрессируемых им белков. Заявляемый здесь способ относится к этой группе.

В настоящее время известен способ детекции вируса лейкоза КРС при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой используют специально синтезированные олигонуклеотиды,комплементарные секвенированной ранее последовательности ДНК вируса,и термостабильную ДНК полимеразу. В качестве образца для ПЦР берут очищенную геномную ДНК, которую выделяют из лейкоцитов тестируемого животного (2).

Известен также способ детекции вируса лейкоза КРС методом иммунофлюорисценции. Эта операция выполняется в два этапа. Сначала иммобилизуют адсорбцией на полистереновых микротитровальных пластинах белки частично очищенного ультрацентрифугированием ВЛКРС, а затем разрушенного эфиром. На втором этапе окрашивают препарат для выявления антигена. Для этой цели используют метод непрямой иммунофлюорисценции, вначале связывая препарат с антисывороткой против ВЛКРС, а затем связавшиеся с антигеном антитела детектируют с антителами конъюгированными с флюоресцеином или щелочной фосфатазой. Таким образом, выявление специфичесого сигнала, определенного конъюгатом, свидетельствует о присутствии вируса лейкоза (3 - прототип).

Известен способ лиганд-блоттинга для распознавания (детекции) вирусных и вирусоподобных частиц эндогенных ретроэлементов, состоящий из нанесения пептидов концентрированной культуральной жидкости на мембрану с последующим связыванием опытного образца с нуклеиновыми кислотами ретроэлемента (РНК или ДНК), меченными радиоактивным или нерадиоактивным способом, основанный на способности ряда доменов структурных белков ретроэлементов эффективно связываться с нуклеиновыми кислотами (4).

В задачу исследований входило разработать чувствительный и прямой способ диагностики лейкоза, в частности способ детекции вируса лейкоза КРС, позволяющий учитывать изменчивость нуклеотидной последовательности вируса, определяя компетентные к экспрессии формы провируса, невосприимчивые к колостральным антителам телят.

Предложенный способ диагностики лейкоза КРС включает следующее.

Из крови получают концентрированный образец белков. Такой образец получают либо из плазмы центрифугированием ее через 20-25% (вес/объем) сахарозную подушку при 70000-100000 g в течение 60-120 минут, либо из лимфоцитов, лизисом клеток неионными детергентами и добавлением к лизату равного объема раствора 20% ПЭГ 8000 в 1 М NaCl и последующего центрифугирования при 12000-30000 g, 15-40 минут. Образец суспендируют в буфере средней ионной силы, рН 7,0-7,8, и белок иммобилизуют на нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране для того, чтобы детектировать структурный белок ВЛКРС. Для этого мембрану с иммобилизованным белком помещают в буфер для лиганд-блоттинга (20 мМ трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCl и 5% обезжиренного молока), куда добавлена меченая денатурированная ДНК вируса, клонированная в бактериальную плазмиду. В этом растворе мембрану инкубируют 6-12 часов и учет результатов проводят по наличию белок-нуклеинового комплекса одним из общепринятых методов детекции нуклеиновых кислот.

Пример 1. Последовательность структурного белка ВЛКРС клонировали в плазмиду РЕТ3 и экспрессировали в бактериальной системе, индуцировав экспрессию добавлением ИПТГ. Лизат бактериальных клеток, продуцирующих исследуемый белок, фракционировали электрофореттически. Для этого белки разделяли в денатурирующем полиакриламидном геле по известному методу Лемли (4). Непосредственно после электрофореза гель промывали 15 мин в буфере следующего состава: 25 мМ трис-HCl, рН 7.3, 0.192 М глицина, 20% метанола. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью электроблоттинга. Затем инкубировали мембраны с клонированной денатурированной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота, меченной дигогсигенином. Идентификацию связавшейся ДНК, меченной дигоксигенином, проводили по цветовой реакции, с использованием конъюгата щелочная фосфатаза-антитела против дигоксигенина по методике фирмы "Boehringer Manheim". Результат, полученный в эксперименте по связыванию ДНК, сравнивали с результатом, полученным после связывания аналогичного образца с антителами к структурному полипротеину ВЛКРС (контроль - прототип). Связавшиеся антитела детектировали методом непрямой иммунофлюорисценции, используя "ECL Western Blotting Detection Reagents" (Amersham Bioscience). В обоих случаях в лизатах был детектирован только пептид, соответствующий структурному полипротеину ВЛКРС. Полученные результаты убедительно показали, что среди множества пептидов только белок, соответствующий структурному полипротеину ВЛКРС, проявляет сродство к ДНК и связывается с ней. Также экспериментально было показано, что белок обладает намного большим сродством к одноцепочечной ДНК, чем к двухцепочечной.

Пример 2. Предложенным способом диагностики был также проведен анализ крови пяти коров с признаками персистемного лимфоцитоза. От экспериментальных животных было получено по 0.5 л плазмы крови. Плазму сперва центрифугировали при 300000 g, 30 мин, а затем супернатант ультрацентрифугировали через 25% (вес/объем) сахарозную подушку при 70000 g в течение 90 минут. Полученный осадок, содержащий белки ВЛКРС, гомогенизировали в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 1 мМ дититреитол, 0.5% Triton X 100. Равные по массовому содержанию белка части препаратов фильтровали через 45 мкм нитроцеллюлозные мембраны, предварительно вымоченные в буфере следующего состава: 10 мМ трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 1 мМ дититреитол. Затем мембраны помещали в буфер для лиганд-блоттинга следующего состава: 20 мМ трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCI и 5% обезжиренного молока, куда добавляли денатурированную ДНК вируса лейкоза, меченную ³²Р в реакции никтрансляции с активностью 10⁸ расп/мин/мкг. Мембрану инкубировали 8 ч при 18°С при постоянном легком встряхивании и не связавшуюся ДНК отмывали шестикратно тем же буфером, в который добавляли гепарин до концентрации 500 мкг/мл. Связавшуюся ДНК детектировали авторадиографией на рентгеновскую пленку. Во всех пяти случаях был получен сигнал, превышающий фоновый, определяемый образцом из плазмы здорового животного, а также образцом бычьего сывороточного альбумина (контроли были нанесены на мембрану в том же самом количестве, что и опытные образцы). Таким образом, предложенный способ позволил выявить вирус лейкоза у больных животных.

Пример 3. Из пяти коров с признаками персистемного лимфоцитоза были взяты образцы крови, из которой были была выделена фракция лейкоцитов в градиенте плотности Percoll с плотностью d=1,080 г/мл. Клетки разрушали в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 7.5,150 мМ NaCl, 1 мМ дититреитол, 0.5% NP40, 0.5% Triton Х100. К полученному лизату добавляли охлажденный до +4°С равный объем раствора 20% ПЕГ8000 в 1 М NaCl. Перемешивали и инкубировали на льду 30 минут. Затем центрифугировали при 20000 g, 10 мин, +4°С. Суспендировали осадок в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 1 мМ дититреитол. Равные по массовому содержанию белка части препаратов фильтровали через 45 мкм нитроцеллюлозные мембраны, предварительно вымоченные в том же самом буфере. Связывание меченой ДНК с белками, иммобилизованными на мембране, проводили в буфере следующего состава: 20 мМ трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCl и 5% обезжиренного молока. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали 6 ч при 18°С при постоянном легком встряхивании. Затем мембрану отмывали шестикратно тем же буфером, в который добавляли гепарин до концентрации 500 мкг/мл. Идентификацию связавшейся ДНК, меченной дигоксигенином, проводили по цветовой реакции, с использованием конъюгата щелочная фосфатаза-антитела против дигоксигенина по методике фирмы "Boehringer Manheim". По той же методике проводили мечение ДНК. Во всех пяти случаях был получен сигнал, превышающий фоновый, т.е. предлагаемый способ позволил выявить заболевание во всех контрольных образцах.

В основе определения ВЛКРС предложенным способом лежит механизм прямого определения структурного белка вируса (Gag) по связыванию с нуклеиновыми кислотами. Этот белок является самым массовым из продуктов вируса, а его частичное обогащение возможно осуществить простыми и быстрыми методами (см. выше) благодаря тому, что структурный белок ВЛКРС сразу после синтеза всегда агрегируется в частицы, вне зависимости от экспрессии других белков вируса. Предложенный способ является принципиально новым, простым в исполнении, чувствительным на любой стадии развития инфекции, позволяет определить экспрессионно компетентную форму провируса, учитывает, в отличие от ПЦР, вариабельность генома вируса. Этот способ позволяют выявить вирус у молодняка, имеющего колостральные антитела.

Предложенный способ опробован нами с положительным результатом в 1995-2003 гг. в лабораториях Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Автономного Университета Барселоны и Научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко РАСХН.

Способ найдет применение для определения не только лейкоза, но и других ретровирусных заболеваний из широкого круга объектов, включая человека. Несомненно, этот способ найдет применение в лабораториях, занимающихся диагностикой лейкоза, и позволит принять меры к резкому снижению процента заболеваемости.

Источники информации

1. Ветеренарная газета. 2002. №10. С.4-5.

2. Naif H.M. et al. Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30, P.675-679.

3. Лейкоз крупного рогатого скота (вирусологические аспекты). ВНИИТЭИСХ. Москва, 1980.

4. Молекулярная биология. 1999. 33. С.423-427. (Издательство МАИК-Наука).

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способам диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Способ заключается в том, что из крови получают концентрированный образец белков ВЛКРС путем центрифугирования при 20000-100000 g, суспендируют его в буфере средней ионной силы с рН 7,0-7,8, иммобилизуют на нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране, помещают в буфер для лиганд-блоттинга, куда добавлена меченая денатурированная ДНК вируса, клонированная в бактериальную плазмиду, и инкубируют 6-12 часов, а детекцию ВЛКРС проводят путем идентификации меченой ДНК, связавшейся со структурным белком вируса, иммобилизованным на мембране. Способ является высокочувствительным на любой стадии развития инфекции, учитывает вариабельность генома вируса и позволяет выявить вирус у молодняка, имеющего колостральные антитела.

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), включающий взятие крови и детекцию ВЛКРС по наличию в ней белка вируса, отличающийся тем, что из крови получают концентрированный образец белков ВЛКРС путем центрифугирования при 20000-100000 g, суспендируют его в буфере средней ионной силы с рН 7,0-7,8, иммобилизуют на нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране, помещают в буфер для лиганд-блоттинга, куда добавлена меченая денатурированная ДНК вируса, клонированная в бактериальную плазмиду и инкубируют 6-12 ч, а детекцию ВЛКРС проводят путем идентификации меченой ДНК, связавшейся со структурным белком вируса, иммобилизованным на мембране.