Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии.
Целью изобретения является получение слитого белка, обладающего активностью белка оболочки бактериофага fr и белка др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Сконструирована рекомбинантная плазмида pFRBLV-F6, которая состоит из следующих элементов:
ДНКплазмиды pRF20 несущей полный ген бактериофага frc внедренным по второй аминокислоте по уникальному сайту рестрикции EcoRV и делецией в гене тетрациклинустойчивости, протяженностью 5279 п о.,
Bglll-BamHI фрагмента ДНК Я HVI, кодирующего участок последовательности др 51 (49 аминокислот), соответствующий 56- 103 аминокислотам зрелого др 51 и содержащего нейтрализующий эпитоп с прилежащими аминокислотами и иммунологический эпитоп - сайт узнавания моноклональных антител тАК14, протяженностью 147 п.о.
8 состав ДНК рекомбинантной плазмиды pFRBLV-F6 входят гены
ген fr CP-BLV др 51 обеспечивающий синтез рекомбинантного белка,
ч
СЛ
Ю
о со
ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. Ген fr CP-BLV др 51 находится под контролем промотора trp.
Плазмида pFRBLV-F6 амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола, неконъюгативна.
Сущность способа конструирования плазмиды pFRBLV-F6 состоит в том, что фрагмент гена др 51 вируса лейкоза внедряется во вторую аминокислоту белка оболочки fr с образованием рекомбинантного гена frCP-BLVflp51.
Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е. coll K802 рекомбиШнтмэй плазмидной ДНК pFRBLV-F6.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные.
Культуральные признаки: клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины.
Физико-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования 37°С, оптимум рН 7,0-7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота - минеральные соли, а также органические соединения в йиде пептона, триптона, аминокислот, ,
Устойчивость к антибиотикам4 устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждается путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделения и анализа плазмидных ДНК экспресс-методом.
Продуктивность штамма составляет 0,5% целевого продукта от общего клеточного белка.
Штамм дёпонирова н в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4984.
Пример 1. Конструирование реком- бинантной плазмидной ДНК pFRBLB-F6.
20 мкг ДНК плазмиды, содержащей Bglll-BamH фрагмент др 51 и выделенной стандартным методом, расщепляют 50 ед. рестриктазы Bglll и 50 ед. рестриктазы BamHI в 100 мкл раствора А, содержащего 0,1 М трис-HCl, рН 7,5, 0,05 М NaCI и 0,01 М MgCh, в течение 2 ч при 37°С. Рестриктазы инактивируют 15 мин прогреванием при 65°С. После очистки ДНК Bgltl-BamHI фрагмента на агарозном геле ДНК растворяют в 20 мкл воды. Заполнение концов проводят в 100 мкл раствора Б, содержащего 0,05 М трис-HCl. рН 7,5, 0,01 MgCl2, 0,01 М дитиот- рейтол, 0,025 М NaCI, 100 мкМ dATP, dCTP, dTTH и dGTP и 10 ед. ДНК-полимеразы Е. coli (фрагмент Кленова), в течение 1 ч при
12°С. После переосаждения этанолом ДНК растворяют в 10 мкл воды (ДНК 1).
2 мкг плазмиды pFR 20 расщепляют 3 ед. рестриктазы EcoRV в 15 мкл раствора В, содержащего 0,01 М трис-HCl,-рН 7,5, 0,05 М NaCI и 0,01 М MgCl2, в течение 1 ч при 37°С, наносят инкубационную смесь на 1,5%-ный агарозный гель. Фрагмент, соответствующий линеаризованной плазмиде 0 pFR 20, выделяют из агарозного геля (ДНК 2),
0,1 мкг ДНК 1 и 0,1 мкг ДНК 2 сшивают Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора Г, содержащего 0,05 М трис-HCl, рН 7,5, 0,01 М 5 MgCla. 0,01 М дитиотрейтол, 50 мкМ АТР и 10 ед. Т4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при 4°С. Фермент инактивируют нагреванием при 65°С в течение 15 мин. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток Е. coll RR1, 0 обработанных 0,1 М CaCh (конечная концентрация 5x10 клеток/мл), для трансформации клеток.
Отбор клонов осуществляют путем экспресс-выделения и секвенирования 5 плазмидной ДНК, выделенной экспресс- методом. Плазмида с ожидаемой последовательностью получает наименование PFRBLV-F6.
Штамм-продуцент Е. coli K802 (pFRBLV- 0 F6).
Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е. coli K802 рекомбинантной плазмидой pFRBLV-F6. Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казами- 5 новые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин 0,02 до оптической плотности ОПево 4-5.
Определение др 51- и fr-активности методом иммуноблотинга.
Для иммуноблотинга клетки (6 мг) сус- 0 пендируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель по Лэммли, содержащего 2%-ный додецил- г-.сульфат натрия (ДСН) и 2%-ный/ -меркапто- ,Чтанол, и лизируют 2 мин прогреванием на 5 -кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2-4 мг/мл белка) наносят на полиакриламидный градиентный гель (12-23%) разме- „ром 150x150x0,75 мм. Электрофорез Проводят в течение 15ч при силе тока 7 мА. 0 После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу.
Фильтры инкубируют с моноклональны- ми анти- др 51 антителами гпАК 14 в разведении 1:500 на буфере TBS, содержащем 5 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,15 М NaCI, 0,1% тритон Х100, 1% БСА, в течение 15 ч при 20°С. После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2°ч при 20°С с конъюгатом пероксидазы с антителами про- тив иммуноглобулинов мыши в разведении
1:500. Фильтры отмывают буфером TBS (3- 5 раз) и проявляют диаминобензидином. В параллельной постановке фильтры инкубируют с анти- fr CP антителами кролика в разведении 1.200 на буфере TBS в течение 15 ч при 20°С. После двукратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20°С с конъюгатом пероксидазы с белком А S. aureus. Лизаты клеток штамма-продуцента обнаруживают в обоих случаях специфические зоны окраски, соответствующие белку с мол.м. 19.32 кДа (или длиной 184 аминокислот). Контрольные лизаты клеток Е. coll K802 таких зон не обнаруживают.
Пример 2. Определение др51-актив- ности в составе слитого белка fr СР-В1У др 51 методом энзимоиммунологического анализа на твердой фазе.
В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций Очищенный белок fr CP-BLV др 51 разводят до концентрации 10 мкг/мл в 50 мМ трис-H.CI, рН 8,0, 0,15 М NaCI и вносят в лунки планшетов - по 100 мкл в каждую. Инкубируют 1 ч при 37°С, после чего раствор удаляют из лунок, планшеты отмывают 4-5 раз дистиллированной водой и высушивают. В лунки вносят моно- клональныеанти-др51 антитела (мыши) или поликлональные анти- fr антитела (кролика) в различных разведениях. После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшеты отмывают дистиллированной водой и вносят по 100 мкл коныогата пероксидазы хрена с антителами против иммуноглобулинов кролика или мыши в разведении 1:500. После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают и проводят цветную реакцию. В лунки йносят по 100 мкл 0,25%-ного раствора ортофени- лендиамина, 2 М HCI в OJ М цитрате натрия, рН 5,0, 0,02% НаОа, инкубируют 30 мин при 20°С, реакцию останавливают добавлением 100 мкл 0,1 H.HCI. Появление коричневой окраски свидетельствует о наличии антигенной активности, для количественной оценки активности измеряют оптическую плотность при 492 нм (табл. 1). Отсутствие реакции в отрицательном контроле (fr CP) свидетельствует о специфичности связывания анти- др 51 ( антител рекомбинантным белком fr CP-BLV др 51.
Пример 3. Иммуногенная активность слитого белка fr CP-BLV др 51.
Для определения иммуногенности рекомбинантным белком fr CP-BLV др 51 иммунизируют кроликов. Для этого смешивают 2 мг белка, растворенного в 1 мл физиологического раствора PBS, с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получают гомогенную эмульсию. Белок вводят подкожно Инъекции антигена повторяют на 14 и 21 день и с 28 дня начинают брать кровь Специфичность антител определяют методом ИФА с использованием двух антигенов1 fr
5 CP (для определения анти- fr CP антител), НВ с Ад - др 51 (для определения др 51 аи гител). Титры антител на 28 день иммунизации приведены в табл. 2.
Таким образом, изобретение позволяет
0 получить слитый белок оболочки РНК-со- держащего бактериофага fr и оболочки руса лейкоза крупного рогатого скота, обладающий иммунологической активностью как по белку бактериофага fr, так и
5 белку др 51 чируса лейкоза крупного рогатого скота.
Формула изобретения
0 1. Рекомбинантная плазммдная ДНК pFRBLV-F6, кодирующая белок оболочки бактериофага fr и белок др 51 вируса лейкоза крупного скота, размером 5426 п.о, и мол.м. 3,48 МДа, содержащая
5 . EcoRV-EcoRV - фрагмент ДНК плазми- ды pFR 20 размером 5279 п.о.,
Bglll-BamHI -фрагментДHKAHV1, кодирующий белок др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота и белок оболочки
0 РНК-содержащего бактериофага fr, размером 147 п о.,
уникальные сайты рестрикции с координатами:
5
0
BspMII- Pstl- Scal - Hpal- Mstll - Sacl- Aval О (начало координат)
1947
2182
3640
3885
4580
4801,
генетические маркерУ и регуляторные участки:
ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину координаты 1629-2489, Ptrp - промотор координаты 3635-2648.
2. Способ конструирования рекомби- нантной плазмидной ДНК pFRBLV-F6, кодирующей белок оболочки бактериофага
fr и белок др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, включающий гидролиз ДНК Я НИ рестриктазами Bglll и BamHI, обработку гидролизата ДНК-полимеразой Е. coli, лигирование фрагментов ДНК с ДНК
плазмиды pFR 20, обработанной рестрикта- зой EcoRV, трансформацию полученной ли- газной смесью клеток Е. coli RRI, отбор путем секвенирования клонов, несущих плазмиду FRBLV-F6.
3. Штамм бактерий Escherlchla coll ВКПМ В 4984-продуцент белка оболочки
бактериофага fr и белка др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Таблица 1
Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии. Целью изобретения является получение слитого белка, обладающего активностью белка оболочки бактериофага fr и белка др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота Получена рекомбинантная плазмидная ДНК pFRBLV-F6, которая состоит из векторной плазмиды pFR 20, несущей ген белка оболочки бактериофага fr под контролем промотора триптофанового оперона, и фрагмента гена др 51 вируса лейкоза крупного рогатого Скота длиной 147 п.о. внедренного в ген белка оболочки по сайту EcoRV, соответствующему второй аминокислоте белка оболочки, с сохранением фаз трансляции как гена др 51, так и гена белка оболочки, белой fr CP-BLVflp 51 состоит из 130 аминокислот белка оболочки и 48 аминокислот др 51 и обладает антигенными свойствами обоих белков. Получен штамм Е coli K802, несущий плазмиду pFRBLV-F6. 3 с.п. ф-лы, 2 табл сл
Иммуногенность рекомбинантного белка fr CP-BLVgp 51
