Рекомбинантная плазмидная ДНК @ FRBLV @ F6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага @ и белок оболочки @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент слитого белка оболочки бактериофага @ и белок оболочки @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота Советский патент 1992 года по МПК C12N15/33 C12N15/70 C12N1/21 

Описание патента на изобретение SU1744110A1

Изобретение относится к микробиологической промышленности генной и белковой инженерии, биотехнологии.

Цель изобретения - получение полипептида с активностью белка оболочки бактериофага fr и белка оболочки др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Сконструирован рекомбинантный ген fr СР-В :V 51 Sh, кодирующий синтез соответствующего белка и плазмиды pFPB LVsF6 для его экспрессии, а также штамма-продуцента, E.coll(pFRB LVsF6).

Рекомбинантная плазмида pFRBLVsF6 состоит из следующих элементов:

ДНК плазмиды pFP20, которая несет полный ген БО fr и имеет делецию в гене тетрациклин - устойчивости,

ВдбП - Есо781 фрагмента ДНК A HV1, кодирующего участок последовательности др51 (9 аминокислот), соответствующий 56- 64 аминокислотам зрелого др51 и содержащего иммунологический эпитоп-сайт узнавания моноклональных антител глАК14.

В состав ДНК рекомбинантной плазмиды pFPBLVsFS входят гены:

о

ген fr CP-BVL51sh, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка;

ген bfa, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

Ген fr CP-BLV51 sh находится под контролем промотора Ptrp.

Плззмида pFRBLVsF6 амплифицирует- ся при добавлении в среду хлорамфеникола, неконьюгативиа.

Сущность способа конструирования пяаэмиды pFRBLVsF6 состоит в том, что фрагмент гена др51 вируса лейкоза, соответствующий нейтрализующему эпитопу с прилежащими аминокислотами (аминокислоты 65-103), выщепляется из плазмиды pFRBLVsF6, содержащей 56-103 аминокислоты др51, с сохранением 56-64 аминокислот др51, соответствующих сайту узнавания моноклональных антител тАК14, и образованием рекомбинантного гена СР-В 51.

Штамм-продуцент fr CP-BLV51 sh получают трансформацией клеток К802 рекомбинантной плазмидной ДНК pFRBLsF6.

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, граммотрицательные.

Культуральные признаки. Клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины.

Физико-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37°С,оптимумрН 7,0 - 7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота - минеральные соли, а также органические соединения & виде пептона , триптона, аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам, Устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плаэмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждается путем проверки устойчивости к ампициллину.

Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4983.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFPBLVs-F6. 20 мкг ДНК плазмиды, содержащей Bgffl- BamH1 фрагмент gp51 и выделенной стандартным методом, расщепляют 50 ед. рестриктазы Bgfl и 50 ед. рестриктазы ВатЖ в 100 мкл раствора А, содержащего 100 мМ трис-НСР, рН 7,5: 50 мМ NaCN 10 мМ MgCfe, в течение 2 ч при 37°С. Рестриктазы инахтивируют 15 мин прогреванием при 65°С. После очистки ДНК Bgfl -BamH1 фрагмента на агарозном геле известным методом ДНК растворяют в 20 мкл НаО. Заполнение концов проводят в 100 мкл раствора Б, содержащего 50 мМ трис HCf, рН 7,5; 10 mM MgCfc, 10 мМ дитиотрейтол, 25 М NaCJ, 100 мМ. dATP, dCTP, dTTP и dGTP и 10 ед. ДНК-полимеразы E.coll (фрагмент Кленова), в течение 1 ч при 12°С. После переосаждения этанолом ДНК

растворяют в 10 мкл (ДНК 1).

2 мкг плазмиды pFP20 расщепляют 3 ед.рестриктазы EcoRV в 25 мкл раствора В, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,5; 50 мМ NaCI и 10 М MgCl2, в течение 1 ч при 37°С,

0 наносят инкубационную смесь на 1,5%-ный агарозный гель, фрагмент, соответствующий линеаризованной плазмиде pFP20, выделяют из агарозного геля (ДНК 2).

0,1 мкг ДНК 1 иО,1 мкг ДНК 2 зашивают

5 Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора Г, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 10 мМ MgCfe, 10 мМ дитиотрейтол, 50 М АТР и 10 ед. Т4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при 4°С. Фрагмент инактивируют нагреванием при

0 65°С в течение 15 мин. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток E.coll RR1, обработанных 100 мМ CaCl2 (конечная концентрация - 5 х 10° клеток/мл), для трансформации клеток.

5 Отбор клонов осуществляют путем экспресс-выделения ДНК и ее рестрикционно- го анализа, а также секвенирования. Плазмида с ожидаемой последовательностью получает наименование pFPBLV-F6.

0Конструирование рекомбинантной

плазмидной ДНК pFPBLVsF6,

2 мкг плазмиды pFPBLV-F6, выделенной стандартным методом, расщепляют 3 ед, растриктазы Есо781 и 3 ед. рестриктазы

5 Ssp1 в 25 мкл раствора А, содержащего 100 мМ трис-HCI. рН 7,5; 50 мМ NaCI и 10 мМ MgCl2, в течение 1 ч при 37°С. Рестриктазы инактивируют 15 мин. прогреванием при 65°С.. Заполнение липких концов

0 проводят в 200 мкл раствора Б, содержащего 50 М трис-HCI. рН 7.5; 10 мМ MgCIa, 10 мМ дитиотрейтол, 25 мМ NaCI, 100 мМ dATP, dCTP, dTTP и dGTP и 5 ед. ДНК-полимеразы E.coli (фрагмент Кленова) в течение

5 1 ч при 12°С. После очистки на агарозном геле ДНК растворяют в 20 мкл Н20 (ДНК 3). 0,05 мкг ДНК 3 зашивают в и ДНК-лигазой в 20 мкл раствора Г, содержащего. 50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 10 мМ , 10 мМ

0 дитиотрейтол, 50 мМ АТР и 10 ед. Т4 ДНК- лигазы, в течение 12 ч при 4°С. Фермент инактивируют нагреванием при 65°С в течение 15 мин. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток Е.соН RR1, обработанных

5 100 мМ CaCIa (конечная концентрация - 5x10° клеток/мл), для трансформации клеток.

Отбор клонов осуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК,

выделенной экспресс-методом, и секвенирования. Плазмида с ожидаемой нуклеотид- ной последовательностью получает наименование pFPBLVsF6.

Штамм-продуцент E.coll K802 (pFPBLVsF6).

Штамм-продуцент получают трансформацией клеток E.coli K802 рекомбинантной плазмидой pFPBLVsFG. Клетки выращивают в солевой бреде М9 с добавкой, г/л: казами- новые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин 0.02 до оптической плотности ОПвбо 4-5.

Определение др51- и fr активности методом иммуноблотинга.

Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель по Лэммли, содержащего 2%-ный додецил- сульфат натрия (ДСН) и 2%-ный/З-меркапто- этанол, и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2-4 мг/мл белка) наносят на полиакрила- мидной, градиентный гель (12-18%) размером 150 х 150 х 0.75 мм. Электрофорез проводят в течение 15 ч при силе тока 7 m А. После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу HAWP. Фильтры инкубируют с моноклональными анти-др51 антителами гпАК14 в разведений 1:500 на буфере TBS, содержащем 50 мМ трис-НО, рН 7,5; 0,15 M NaCI; 0.1% тритон Х-100; 1% БСА, в течение 15ч при 20°С После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20°С с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:500. Фильтры отмывают буфером TBS (3-5 раз) и проявляют диами- нобензидином. В параллельной постановке фильтры инкубируют с анти-frCP антителами кролика в разведении 1:200 на буфере TBS в течение 15ч при 20°С. После двукратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20°С с конъюгатом пероксидазы с белком A S.aureus. Лизаты клеток штамма - продуцента обнаруживают в обоих случаях специфические зоны окраски, соответствующие белку с молекулярной массой 14,7 КД (или длиной 140 аминокислот), что соответствует ожидаемому по схеме конструирования.

Определение титра fr CP-BLV51 sh методом РИД.

Титр определяют с помощью радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони. Для этого готовят двукратные серийные разведения клеточного лизата и титруют против v анти-fr СР антител кролика. В качестве стандарта используют очищенный frCP, полученный из рекомбинантных бактерий 5 (1 мг/мл). Результаты титрования frCP- 8LV51sh активности методом РИД приведены в таблице.

Формула изобретения

1.Рекомбинантная плазмидная ДНК 0 pFPBLVsF6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага fr и блок оболочки др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота размером 5297 п.о. и мол.м. 3,39 моль, содержащая плазмидную ДНК pFP20 размером

5 5268 п.о. и мол.м. 3,38 моль; Bgfl -Eco781 - фрагмент ДНК A HV1, размером 29 п.о. и мол.м. 0,01 моль, кодирующий аминокислотную последовательность белка др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота с 56 по

0 64-ю аминокислоту; уникальные сайты рестрикции со следующими координатами: ВЗрМП (0 - начало координат), PSt1 (1947), Sea 1 (2182)- Нра1 (3640). MSt II (3885), Sac I (4451), AVal (4672); гены, генетические мар5 керы; регуляторные участки: ген fr CP- BLVgp51 Sh, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка fr CP-BLVgp51 Sh; ген bfa, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; промотор триптофанового опе0 рона - Ptrp из E.coli, под контролем которого находится ген fr CP-BLVgp51 Sh; неконъютативна.

2.Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pFPBLVsF6. ко5 дирующий слитый белок оболочки бактериофига fr - и белок оболочки др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, заключающийся втом,чтоВдЙ1-ВаглН1 фрагмент ДНК A HV1 обрабатывают ДНК 0 полимеразой E.coli и встраивают в ДНК плазмиды pFP20 по сайту для эндонуклеазы рестрикции ЕсоР. отбирают клоны, содержащие плазмиду pFPBLV-F6, из которой вы- щепляют участок ДНК, находящийся между

5 сайтами для рестриктаз Есо781 и SSp11, обрабатывают ДНК-полимеразой E.coll и отбирают клоны, содержащие плззмиду pFPBLVsF6 и синтезирующие белок fr CP BLVgp51 Sh.

0 3. Штамм бактерий E.coll ВКПМ В-4983- продуцент рекомбинантного слитного белка оболочки бактериофага fr и белок оболочки др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

5

Похожие патенты SU1744110A1

название год авторы номер документа
Рекомбинантная плазмидная ДНК pFRBLV - F6, кодирующая белок оболочки бактериофага @ и белок @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент белка оболочки бактериофага @ и белка @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота 1989
  • Ульрих Райнер
  • Сиаккоу Хельга
  • Платцер Корнелия
  • Розенталь Зинаида
  • Розенталь Ханс Альфред
  • Козловская Татьяна Минаевна
  • Соминская Ирина Витальевна
  • Дрейлиня Дзидра Эдвиновна
  • Бреде Артис Янович
  • Озолс Юрис Арвидович
  • Пушко Петр Мечиславович
  • Пумпен Павел Павлович
  • Грен Элмар Янович
SU1751208A1
Рекомбинантная плазмидная ДНК @ BLV 51-3, кодирующая кор-антиген вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности эпитопом BLV @ 51 (56-103), вируса лейкоза крупного рогатого скота способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности эпитопом BLV @ 51 (56-103) 1989
  • Ульрих Райнер
  • Сиаккоу Хельга
  • Платцер Корнелия
  • Розенталь Зинаида
  • Розенталь Ханс Альфред
  • Борисова Галина Павловна
  • Берзинь Ивар Гунарович
  • Дрейлиня Дзидра Эдвиновна
  • Лосева Вера Яновна
  • Озолс Юрис Арвидович
  • Осе Велта Петровна
  • Пушко Петр Мечиславович
  • Цибиногин Владимир Викторович
  • Пумпен Павел Павлович
  • Грен Элмар Янович
SU1742331A1
Рекомбинантная плазмидная ДНК pHIV 24-5, кодирующая слитый белок кор-антигена вируса гепатита В и белок оболочки вируса иммунодефицита человека, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент слитого белка кор-антигена вируса гепатита В и белка оболочки вируса иммунодефицита человека 1989
  • Ульрих Райнер
  • Меринг Регина
  • Лэтч Ингрид
  • Петцольд Гюнтер
  • Порстман Томас
  • Розенталь Ханс Альфред
  • Борисова Галина Павловна
  • Берзинь Ивар Гунарович
  • Дрейлиня Дзидра Эдвиновна
  • Лосева Вера Яновна
  • Озолс Юрис Арвидович
  • Осе Велта Петровна
  • Цибиногин Владимир Викторович
  • Пумпен Павел Павлович
  • Грен Элмар Янович
SU1751209A1
Рекомбинантная плазмидная ДНК pHIV 41-22, кодирующая кор-антиген вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности фрагментом белка @ 41 вируса иммунодефицита человека, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности фрагментом белка @ 41 вируса иммунодефицита человека 1989
  • Ульрих Райнер
  • Меринг Регина
  • Лэтч Ингрид
  • Порстманн Томас
  • Петцольд Гюнтер
  • Розенталь Ханс Альфред
  • Борисова Галина Павловна
  • Берзинь Ивар Гунарович
  • Дрейлиня Дзидра Эдвиновна
  • Лосева Вера Яновна
  • Озолс Юрис Арвидович
  • Осе Велта Петровна
  • Цибиногин Владимир Викторович
  • Пумпен Павел Павлович
  • Грен Элмар Янович
  • Пушко Петр Мечиславович
SU1751210A1
Рекомбинантная плазмидная ДНК pGCS1-39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В, с экспонированным на его поверхности эпитопом р S1(20-68), способ ее конструирования и штамм бактерии Е.CoLI - продуцент кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности эпитопом pS1(20-68) 1989
  • Борисова Галина Павловна
  • Берзинь Ивар Гунарович
  • Грен Элмар Янович
  • Лосева Вера Яновна
  • Осе Велта Петровна
  • Озолс Юрис Арвидович
  • Пумпен Павел Павлович
  • Пушко Петр Мечиславович
  • Цибиногин Владимир Викторович
SU1740418A1
Рекомбинантная плазмидная ДНК УЕ pSG94,кодирующая синтез производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота,способ ее конструирования и штамм дрожжей SасснаRомUсеS ceReRRIaL-продуцент производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота 1985
  • Баев Александр Александрович
  • Скрябин Константин Георгиевич
  • Эльдаров Михаил Анатольевич
  • Розенталь Зинаида
  • Рослер Хельга
  • Брантл Сабина
  • Ланг Гартмут
SU1337408A1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PGSDEI, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК E ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА И ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА E ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА 1997
  • Нетесова Н.А.
  • Белавин П.А.
  • Малыгин Э.Г.
  • Рукавишников М.Ю.
RU2136754C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PESG, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PESG И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАНТНУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК PESG, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ 485 А.К., ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ ПОВЕРХНОСТНОГО ГЛИКОПРОТЕИНА ВИРУСА Т-КЛЕТОЧНОГО ЛЕЙКОЗА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА 1994
  • Гараев М.М.
  • Бобков А.Ф.
  • Санков М.Н.
RU2081172C1
Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая кор-антиген вируса гепатита В, лишенный ДНК 39С концевых аминокислот с экспонированным на его поверхности эпитопом pRe S @ / 1-55/, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент кор-антигена, вируса гепатита В, лишенного 39 С концевых аминокислот с экспонированным на его поверхности эпитопом pRe S @ /1-55/ 1989
  • Борисова Галина Павловна
  • Берзинь Ивар Гунарович
  • Грен Элмар Янович
  • Лосева Вера Яновна
  • Петровский Ивар Алфредович
  • Пумпен Павел Павлович
  • Пушко Петр Мечиславович
  • Озолс Юрис Арвидович
  • Осе Велта Петровна
  • Цибиногин Владимир Викторович
SU1713930A1
Рекомбинантная плазмидная ДНК @ 10FMD, кодирующая гибридный белок Р204-AS @ Р @ С @ С @ - VPI/200-213/ Р @ Р @ S @ Р @ ( 131-160) и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI -продуцент гибридного белка Р204- А @ Р @ С @ С @ V PI/200-213/-Р @ Р @ S @ Р @ - VPI /131-160/ 1990
  • Коробко Вячеслав Григорьевич
  • Филиппов Сергей Александрович
  • Добрынин Владимир Николаевич
  • Болдырева Елена Филипповна
  • Микульскис Альвидас Владович
  • Некрасова Оксана Васильевна
  • Иванющенков Владимир Никифорович
  • Бурдов Александр Николаевич
  • Дрягалин Николай Николаевич
  • Чепуркин Анатолий Васильевич
SU1724691A1

Реферат патента 1992 года Рекомбинантная плазмидная ДНК @ FRBLV @ F6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага @ и белок оболочки @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент слитого белка оболочки бактериофага @ и белок оболочки @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота

Изобретение относится к микробиологической промьнвлеми0Ји. и белковой инженерии, 6«e ejroe H0f«w. Целью изобретения являете получение слитного белка оболочки fr и бегишфц 51 вируса лейкоза крупнот рогатого евета и создание штамма Es-herteW евМ иеерцега «лазмиду pFRBLVsF6, иодирукш синтез указанного белка. Изобретение т себя конструирование йлазммди i FR BLVsF6, заключающееся 09 в велении фрагмента Sgll-Eco 781 ДНК пяазмиды Д HU1 в плаз- миду pFR 20. У никаяьн ееайты рестрикции: BspMII, pStl, Scat. Hpal, MStlt, Sac). Aval. Продуктивность штамму 5% целевого про-, j дукта от общего кяетом«вп5§еякэ, Плазмида вводится трансформацией 8 клети E.colf к 802 с последующим отбором штамма-продуцента рекомбинантногв белка i.coli ВКПМ В-4983. 3 с.п.ф-лы, t тйВя. сл с ё

Формула изобретения SU 1 744 110 A1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1992 года SU1744110A1

Neuroth A.L
and Kent S.B.H
in odvaftces Invirus research, 1988
Нивелир для отсчетов без перемещения наблюдателя при нивелировании из средины 1921
  • Орлов П.М.
SU34A1
Разборное приспособление для накатки на рельсы сошедших с них колес подвижного состава 1920
  • Манаров М.М.
SU65A1
Козловская Т.М
и др
Докл
АН СССР
Пневматический водоподъемный аппарат-двигатель 1917
  • Кочубей М.П.
SU1986A1
стр
Устройство для преобразования движения поршня двигателя во вращательное движение вала 1922
  • Лаптин К.С.
SU452A1
Nyakafura Е
Приспособление для установки двигателя в топках с получающими возвратно-поступательное перемещение колосниками 1917
  • Р.К. Каблиц
SU1985A1
Способ очистки нефти и нефтяных продуктов и уничтожения их флюоресценции 1921
  • Тычинин Б.Г.
SU31A1
Ударно-долбежная врубовая машина 1921
  • Симонов Н.И.
SU115A1

SU 1 744 110 A1

Авторы

Ульрих Райнер

Сиаккоу Хельга

Платцер Кортелия

Розенталь Зинаида

Розенталь Ханс Альфред

Козловская Татьяна Минаевна

Соминская Ирина Витальевна

Дрейлиня Дзидра Эдвиновна

Озолс Юрис Арвидович

Пушко Петр Мечиславович

Пумпен Павел Павлович

Грен Элмар Янович

Даты

1992-06-30Публикация

1989-08-10Подача