Рекомбинантная плазмидная ДНК @ FRBLV @ F6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага @ и белок оболочки @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент слитого белка оболочки бактериофага @ и белок оболочки @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота Советский патент 1992 года по МПК C12N15/33 C12N15/70 C12N1/21 

Изобретение относится к микробиологической промышленности генной и белковой инженерии, биотехнологии.

Цель изобретения - получение полипептида с активностью белка оболочки бактериофага fr и белка оболочки др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Сконструирован рекомбинантный ген fr СР-В :V 51 Sh, кодирующий синтез соответствующего белка и плазмиды pFPB LVsF6 для его экспрессии, а также штамма-продуцента, E.coll(pFRB LVsF6).

Рекомбинантная плазмида pFRBLVsF6 состоит из следующих элементов:

ДНК плазмиды pFP20, которая несет полный ген БО fr и имеет делецию в гене тетрациклин - устойчивости,

ВдбП - Есо781 фрагмента ДНК A HV1, кодирующего участок последовательности др51 (9 аминокислот), соответствующий 56- 64 аминокислотам зрелого др51 и содержащего иммунологический эпитоп-сайт узнавания моноклональных антител глАК14.

В состав ДНК рекомбинантной плазмиды pFPBLVsFS входят гены:

о

ген fr CP-BVL51sh, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка;

ген bfa, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

Ген fr CP-BLV51 sh находится под контролем промотора Ptrp.

Плззмида pFRBLVsF6 амплифицирует- ся при добавлении в среду хлорамфеникола, неконьюгативиа.

Сущность способа конструирования пяаэмиды pFRBLVsF6 состоит в том, что фрагмент гена др51 вируса лейкоза, соответствующий нейтрализующему эпитопу с прилежащими аминокислотами (аминокислоты 65-103), выщепляется из плазмиды pFRBLVsF6, содержащей 56-103 аминокислоты др51, с сохранением 56-64 аминокислот др51, соответствующих сайту узнавания моноклональных антител тАК14, и образованием рекомбинантного гена СР-В 51.

Штамм-продуцент fr CP-BLV51 sh получают трансформацией клеток К802 рекомбинантной плазмидной ДНК pFRBLsF6.

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, граммотрицательные.

Культуральные признаки. Клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины.

Физико-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37°С,оптимумрН 7,0 - 7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота - минеральные соли, а также органические соединения & виде пептона , триптона, аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам, Устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плаэмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждается путем проверки устойчивости к ампициллину.

Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4983.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFPBLVs-F6. 20 мкг ДНК плазмиды, содержащей Bgffl- BamH1 фрагмент gp51 и выделенной стандартным методом, расщепляют 50 ед. рестриктазы Bgfl и 50 ед. рестриктазы ВатЖ в 100 мкл раствора А, содержащего 100 мМ трис-НСР, рН 7,5: 50 мМ NaCN 10 мМ MgCfe, в течение 2 ч при 37°С. Рестриктазы инахтивируют 15 мин прогреванием при 65°С. После очистки ДНК Bgfl -BamH1 фрагмента на агарозном геле известным методом ДНК растворяют в 20 мкл НаО. Заполнение концов проводят в 100 мкл раствора Б, содержащего 50 мМ трис HCf, рН 7,5; 10 mM MgCfc, 10 мМ дитиотрейтол, 25 М NaCJ, 100 мМ. dATP, dCTP, dTTP и dGTP и 10 ед. ДНК-полимеразы E.coll (фрагмент Кленова), в течение 1 ч при 12°С. После переосаждения этанолом ДНК

растворяют в 10 мкл (ДНК 1).

2 мкг плазмиды pFP20 расщепляют 3 ед.рестриктазы EcoRV в 25 мкл раствора В, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,5; 50 мМ NaCI и 10 М MgCl2, в течение 1 ч при 37°С,

0 наносят инкубационную смесь на 1,5%-ный агарозный гель, фрагмент, соответствующий линеаризованной плазмиде pFP20, выделяют из агарозного геля (ДНК 2).

0,1 мкг ДНК 1 иО,1 мкг ДНК 2 зашивают

5 Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора Г, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 10 мМ MgCfe, 10 мМ дитиотрейтол, 50 М АТР и 10 ед. Т4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при 4°С. Фрагмент инактивируют нагреванием при

0 65°С в течение 15 мин. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток E.coll RR1, обработанных 100 мМ CaCl2 (конечная концентрация - 5 х 10° клеток/мл), для трансформации клеток.

5 Отбор клонов осуществляют путем экспресс-выделения ДНК и ее рестрикционно- го анализа, а также секвенирования. Плазмида с ожидаемой последовательностью получает наименование pFPBLV-F6.

0Конструирование рекомбинантной

плазмидной ДНК pFPBLVsF6,

2 мкг плазмиды pFPBLV-F6, выделенной стандартным методом, расщепляют 3 ед, растриктазы Есо781 и 3 ед. рестриктазы

5 Ssp1 в 25 мкл раствора А, содержащего 100 мМ трис-HCI. рН 7,5; 50 мМ NaCI и 10 мМ MgCl2, в течение 1 ч при 37°С. Рестриктазы инактивируют 15 мин. прогреванием при 65°С.. Заполнение липких концов

0 проводят в 200 мкл раствора Б, содержащего 50 М трис-HCI. рН 7.5; 10 мМ MgCIa, 10 мМ дитиотрейтол, 25 мМ NaCI, 100 мМ dATP, dCTP, dTTP и dGTP и 5 ед. ДНК-полимеразы E.coli (фрагмент Кленова) в течение

5 1 ч при 12°С. После очистки на агарозном геле ДНК растворяют в 20 мкл Н20 (ДНК 3). 0,05 мкг ДНК 3 зашивают в и ДНК-лигазой в 20 мкл раствора Г, содержащего. 50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 10 мМ , 10 мМ

0 дитиотрейтол, 50 мМ АТР и 10 ед. Т4 ДНК- лигазы, в течение 12 ч при 4°С. Фермент инактивируют нагреванием при 65°С в течение 15 мин. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток Е.соН RR1, обработанных

5 100 мМ CaCIa (конечная концентрация - 5x10° клеток/мл), для трансформации клеток.

Отбор клонов осуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК,

выделенной экспресс-методом, и секвенирования. Плазмида с ожидаемой нуклеотид- ной последовательностью получает наименование pFPBLVsF6.

Штамм-продуцент E.coll K802 (pFPBLVsF6).

Штамм-продуцент получают трансформацией клеток E.coli K802 рекомбинантной плазмидой pFPBLVsFG. Клетки выращивают в солевой бреде М9 с добавкой, г/л: казами- новые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин 0.02 до оптической плотности ОПвбо 4-5.

Определение др51- и fr активности методом иммуноблотинга.

Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель по Лэммли, содержащего 2%-ный додецил- сульфат натрия (ДСН) и 2%-ный/З-меркапто- этанол, и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2-4 мг/мл белка) наносят на полиакрила- мидной, градиентный гель (12-18%) размером 150 х 150 х 0.75 мм. Электрофорез проводят в течение 15 ч при силе тока 7 m А. После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу HAWP. Фильтры инкубируют с моноклональными анти-др51 антителами гпАК14 в разведений 1:500 на буфере TBS, содержащем 50 мМ трис-НО, рН 7,5; 0,15 M NaCI; 0.1% тритон Х-100; 1% БСА, в течение 15ч при 20°С После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20°С с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:500. Фильтры отмывают буфером TBS (3-5 раз) и проявляют диами- нобензидином. В параллельной постановке фильтры инкубируют с анти-frCP антителами кролика в разведении 1:200 на буфере TBS в течение 15ч при 20°С. После двукратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20°С с конъюгатом пероксидазы с белком A S.aureus. Лизаты клеток штамма - продуцента обнаруживают в обоих случаях специфические зоны окраски, соответствующие белку с молекулярной массой 14,7 КД (или длиной 140 аминокислот), что соответствует ожидаемому по схеме конструирования.

Определение титра fr CP-BLV51 sh методом РИД.

Титр определяют с помощью радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони. Для этого готовят двукратные серийные разведения клеточного лизата и титруют против v анти-fr СР антител кролика. В качестве стандарта используют очищенный frCP, полученный из рекомбинантных бактерий 5 (1 мг/мл). Результаты титрования frCP- 8LV51sh активности методом РИД приведены в таблице.

Формула изобретения

1.Рекомбинантная плазмидная ДНК 0 pFPBLVsF6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага fr и блок оболочки др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота размером 5297 п.о. и мол.м. 3,39 моль, содержащая плазмидную ДНК pFP20 размером

5 5268 п.о. и мол.м. 3,38 моль; Bgfl -Eco781 - фрагмент ДНК A HV1, размером 29 п.о. и мол.м. 0,01 моль, кодирующий аминокислотную последовательность белка др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота с 56 по

0 64-ю аминокислоту; уникальные сайты рестрикции со следующими координатами: ВЗрМП (0 - начало координат), PSt1 (1947), Sea 1 (2182)- Нра1 (3640). MSt II (3885), Sac I (4451), AVal (4672); гены, генетические мар5 керы; регуляторные участки: ген fr CP- BLVgp51 Sh, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка fr CP-BLVgp51 Sh; ген bfa, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; промотор триптофанового опе0 рона - Ptrp из E.coli, под контролем которого находится ген fr CP-BLVgp51 Sh; неконъютативна.

2.Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pFPBLVsF6. ко5 дирующий слитый белок оболочки бактериофига fr - и белок оболочки др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, заключающийся втом,чтоВдЙ1-ВаглН1 фрагмент ДНК A HV1 обрабатывают ДНК 0 полимеразой E.coli и встраивают в ДНК плазмиды pFP20 по сайту для эндонуклеазы рестрикции ЕсоР. отбирают клоны, содержащие плазмиду pFPBLV-F6, из которой вы- щепляют участок ДНК, находящийся между

5 сайтами для рестриктаз Есо781 и SSp11, обрабатывают ДНК-полимеразой E.coll и отбирают клоны, содержащие плззмиду pFPBLVsF6 и синтезирующие белок fr CP BLVgp51 Sh.

0 3. Штамм бактерий E.coll ВКПМ В-4983- продуцент рекомбинантного слитного белка оболочки бактериофага fr и белок оболочки др51 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

5

Изобретение относится к микробиологической промьнвлеми0Ји. и белковой инженерии, 6«e ejroe H0f«w. Целью изобретения являете получение слитного белка оболочки fr и бегишфц 51 вируса лейкоза крупнот рогатого евета и создание штамма Es-herteW евМ иеерцега «лазмиду pFRBLVsF6, иодирукш синтез указанного белка. Изобретение т себя конструирование йлазммди i FR BLVsF6, заключающееся 09 в велении фрагмента Sgll-Eco 781 ДНК пяазмиды Д HU1 в плаз- миду pFR 20. У никаяьн ееайты рестрикции: BspMII, pStl, Scat. Hpal, MStlt, Sac). Aval. Продуктивность штамму 5% целевого про-, j дукта от общего кяетом«вп5§еякэ, Плазмида вводится трансформацией 8 клети E.colf к 802 с последующим отбором штамма-продуцента рекомбинантногв белка i.coli ВКПМ В-4983. 3 с.п.ф-лы, t тйВя. сл с ё