СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАТОКСИНА Bordetella pertussis Российский патент 2006 года по МПК A61K39/10 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для производства бесклеточной коклюшной вакцины.

Известен способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделения из него токсина с последующей детоксикацией формалином и сорбцией анатоксина на гидроокиси алюминия, токсин из супернатанта выделяют осаждением 3-7%-ным раствором гексаметафосфата натрия в присутствии 0,002-0,006 М растворов соляной, серной и трихлоруксусной кислот при рН 3,4-3,6, а детоксикацию токсина проводят в 8-12%-ном растворе сахарозы (RU 1369042, А 61 К 39/10, 1986 г.).

Проблема получения высокоэффективных низкотоксичных вакцин для профилактики коклюшной инфекции остается актуальной, поскольку применяемая в практике корпускулярная вакцина обладает высокой реактогенностью, а бесклеточные коклюшные вакцины характеризуются выраженной протективной активностью и более низкой токсичностью.

Повышение протективной активности бесклеточной коклюшной вакцины - одно из важных условий совершенствования этих препаратов.

Технический результат заявленного способа заключается в получении высокоактивного и низкотоксичного анатоксина Bordetella pertussis.

Для достижения указанного технического результата в способе получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, стабилизации его сахарозой, выделения из него токсического материала, детоксикацию токсического материала формалином и сорбцией анатоксина на геле гидроокиси алюминия, согласно изобретению после сорбции полученного анатоксина на геле гидроокиси алюминия сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02-0,2%.

Кроме того, стабилизацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-4% с последующим выдерживанием смеси при 4-10°С в течение 16-20 часов.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах выполнения способа.

Пример 1. Штамм 475a Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-ой пассаж) инокулируют до концентрации 3,0 -3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 оборотов в минуту в течение 60 минут.

К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 3%. Смесь помещают в холодильник при 4-10°С в течение 16 часов. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия, 2 мл 2 Н соляной, 2 мл 2 Н серной кислот и рН смеси доводят до 3,4 2 Н трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,4%. Детоксикацию препарата проводят в термостате при 37°С в течение 17 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл в течение 20 часов в холодильнике при 4-10°С. Сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02%.

Пример 2. Штамм 475a Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-ой пассаж) инокулируют до концентрации 3,0-3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 оборотов в минуту в течение 60 минут.

К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 4%. Смесь помещают в холодильник при 4-10°С в течение 20 часов. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия, 2 мл 2 Н соляной, 2 мл 2 Н серной кислоты и рН смеси доводят до 3,5 2 Н трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,4%. Детоксикацию препарата проводят в термостате при 37°С в течение 17 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл в течение 20 часов в холодильнике при 4-10°С. Сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,2%.

Сравнительное изучение протективной активности анатоксинов, полученных предлагаемым и известным способами, показало, что препараты, полученные предлагаемым способом, были в 2 раза активнее препаратов, полученных известным способом. Средняя иммунизирующая доза (ED₅₀) анатоксинов, полученных заявляемым способом, составляла 0,0992 (0,0830:0,1152) мкг белкового азота, а ED₅₀ анатоксина, полученного известным способом составляла 0,2144 (0,1856:0,2432) мкг белкового азота.

Различия были статистически достоверны при р>0,001.

Индекс резистентности к заражению вирулентной культурой Bordetella pertussis мышей, иммунизированных анатоксином, приготовленньм по заявляемому способу, составил 7,9-9,34, а мышей, иммунизированных анатоксином, приготовленным известным способом, составлял 3,1, что свидетельствует о более высокой напряженности иммунитета, вызываемого анатоксином, приготовленным заявленным способом.

Анатоксин, полученный заявленным способом, в иммунизирующей дозе для человека не сенсибилизировал мышей к гистамину дигидрохлориду (гибель составляла 0%), а анатоксин, полученный известным способом, вызывал гибель 14,28% мышей после введения гистамина, что свидетельствует о более низкой токсичности анатоксина, полученного заявленным способом.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для производства бесклеточной коклюшной вакцины. Сущность способа заключается в получении анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, стабилизации его сахарозой, выделения из него токсического материала, детоксикации токсического материала формалином и сорбции анатоксина на геле гидроокиси алюминия. После сорбции полученного анатоксина на геле гидроокиси алюминия сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02-0,2%. Кроме того, стабилизацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-4% с последующим выдерживанием смеси при 4-10°С в течение 16-20 часов. Способ позволяет получать высокоактивный низкотоксичный анатоксин Bordetella pertussis, который может быть использован для получения бесклеточной коклюшной вакцины. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, стабилизации его сахарозой, выделения из него токсического материала, детоксикации токсического материала формалином и сорбции анатоксина на геле гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что после сорбции полученного анатоксина на геле гидроокиси алюминия сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02-0,2%.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-4% с последующим выдерживанием смеси при 4-10°С в течение 16-20 ч.