СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ КОКЛЮША Российский патент 2014 года по МПК A61K39/10 A61P31/00 

Описание патента на изобретение RU2504399C1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при производстве высокоиммуногенных безвредных препаратов для профилактики коклюша.

Известен способ получения бесклеточных коклюшных вакцин на основе индивидуально очищенных антигенов Bordetella pertussis с последующим их объединением в готовом препарате, такие вакцины содержат в своем составе от 1 до 5 очищенных антигенов. Однако до настоящего времени остается не ясна роль отдельных антигенов Bordetella pertussis в отношении их вклада в обеспечение протективной функции иммунопрофилактического препарата. Вместе с тем в настоящий момент наблюдается тенденция повышения эффективности бесклеточных коклюшных вакцин за счет включения в их состав от 3 до 5 антигенных компонентов (Еженедельный эпидемиологический бюллетень, 2010, №40, 385-400). Таким образом, является целесообразным получение препаратов, содержащих природный комплекс антигенов Bordetella pertussis, обладающий наиболее оптимальным соотношением протективных антигенов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению аналогом (прототип) является способ получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша (описание к патенту №2332231 на изобретение «Способ получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша» МПК А61К 39/10, опубликован 10.02.2008), включающий выращивание культуры Bordetella pertussis на питательной среде КУА (казеиново-угольный агар) при (36±1)°С в течение 48 часов с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды, при этом в микробной суспензии, содержащей 70±10 ME микробных клеток, устанавливают рН 8,4±0,1, после чего в суспензию добавляют водный раствор дезоксихолата натрия до конечной концентрации 0,5% и выдерживают при температуре (3±1)°С в течение 2 часов, затем полученный комплекс антигенов Bordetella pertussis отделяют от биомассы центрифугированием, подвергают диафильтрации, ультрафильтрации, обезвреживают 0,03% формалина при рН 7,6±0,2 и температуре (36±3)°С в течение 3 суток. Обезвреженный комплекс антигенов Bordetella pertussis осаждают соляной кислотой при рН 3,5±0,3 в присутствии 0,30±0,05% гексаметафосфата натрия. Полученный осадок растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 7,1±0,3 и проводят стерилизующую фильтрацию готового продукта. Однако препарат, получаемый данным способом, является пирогенным (содержит более 100 эндотоксических единиц (ЭЕ) в одной человеческой дозе), вследствие чего не соответствует международным требованиям, предъявляемым к бесклеточным коклюшным вакцинам (European pharmocopeia 6.0 01/2008:1595).

Признаки известного технического решения, совпадающие с признаками заявленного изобретения, заключаются в выращивании штаммов Bordetella pertussis на среде КУА с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды, установлении в суспензии концентрации микробных клеток 60-80 ME при рН 8,4±0,1, экстракции комплекса антигенов Bordetella pertussis 0,5% раствором дезоксихолата натрия, отделении его от клеток центрифугированием, очистке от низкомолекулярных балластных примесей диафильтрацией.

Задачей, решаемой изобретением, является повышение качества бесклеточной коклюшной вакцины.

Технический результат, обеспечивающий решение указанной задачи, заключается в снижении уровня содержания эндотоксинов Bordetella pertussis в препарате бесклеточной коклюшной вакцины.

Технический результат достигается тем, что в известном способе получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша, включающем выращивание культуры Bordetella pertussis на казеиново-угольном агаре с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды, установление в суспензии концентрации микробных клеток 60-80 ME и рН 8,4±0,1, экстракцию комплекса антигенов Bordetella pertussis 0,5% раствором дезоксихолата натрия, отделение его от микробных клеток центрифугированием и очистку диафильтрацией от низкомолекулярных балластных примесей, согласно изобретению комплекс антигенов Bordetella pertussis переводят в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09 М NaCl, а удаление эндотоксинов из комплекса антигенов Bordetella pertussis проводят с помощью хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005 М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl, после чего комплекс антигенов Bordetella pertussis обезвреживают 0,100±0,025% формалина при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток.

Перевод комплекса антигенов Bordetella pertussis в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09 М NaCl, осуществляется для обеспечения условий хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005 М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl, которую проводят для снижения уровня содержания эндотоксинов в комплексе антигенов Bordetella pertussis. Концентрация формалина 0,100±0,025% при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток обеспечивает полное обезвреживание токсических компонентов комплекса антигенов Bordetella pertussis.

Новыми признаками заявленного способа по отношению к прототипу являются: перевод комплекса антигенов в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09 М NaCl; удаление эндотоксинов из комплекса антигенов путем проведения хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005 М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl; обезвреживание комплекса антигенов Bordetella pertussis 0,100±0,025% формалина при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток.

Способ получения препарата осуществляется следующим образом. Для изготовления вакцины используют 3-5 штаммов возбудителя коклюша Bordetella pertussis 1 фазы. Микробы выращивают на КУА в матрацах при (36±1)°С в течение 48 часов. По истечении указанного времени выросшую культуру в каждом матраце контролируют на бактериологическую чистоту и типичность морфологии микробных клеток путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. С каждого матраца с культурой Bordetella pertussis, удовлетворяющей требованиям по морфологии и чистоте, производят смыв культуры стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2). Бактериальную суспензию сливают в стерильную бутыль. Производят стандартизацию суспензии по оптическому стандарту мутности, устанавливая концентрацию 60-80 ME микробных клеток в 1 мл суспензии. В стандартизованной суспензии устанавливают рН 8,4±0,1 с помощью 5% раствора натрия гидроксида. К охлажденной до (3±1)°С микробной суспензии, содержащей 60-80 ME, добавляют 10% раствор дезоксихолата натрия до конечной концентрации его в суспензии, равной 0,5%, и выдерживают при температуре (3±1)°С в течение двух часов при периодическом перемешивании. После этого комплекс антигенов Bordetella pertussis отделяют от биомассы посредством центрифугирования. Полученный раствор комплекса антигенов Bordetella pertussis подвергают осветляющей фильтрации через мембраны с диаметром пор 1-3 мкм. Затем проводят очистку целевого продукта на ультрафильтрационной установке с мембранными модулями. Вначале проводят диафильтрацию против 0,9% раствора натрия хлорида, затем переводят в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09М NaCl. По окончании диафильтрации целевой продукт концентрируют до исходного объема, устанавливают рН 7,3±0,2, подвергают микрофильтрации через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм. Далее проводят дополнительную очистку комплекса антигенов для снижения уровня содержания эндотоксина Bordetella pertussis с помощью хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl. При прохождении раствора через колонну происходит адсорбция эндотоксической составляющей на смолу, а целевой продукт выходит транзитом. Элюцию комплекса антигенов Bordetella pertussis контролируют спектрофотометрически, фракцию, содержащую комплекс антигенов Bordetella pertussis, собирают в емкость, добавляют формалин до концентрации 0,100±0,025%, устанавливают рН 7,6±0,2. Затем проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, полученный раствор выдерживают при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток до полного обезвреживания токсических компонентов препарата. Данная технология позволяет получить препарат коклюшного антигенного комплекса со сниженным содержанием эндотоксинов (табл.1) и с полноценной антигенной структурой, которая соответствует антигенной структуре широко применяемого в настоящее время цельноклеточного коклюшного компонента комбинированной АКДС-вакцины (табл.2).

Таблица 1 Содержание эндотоксинов Bordetella pertussis в препаратах бесклеточного коклюшного антигена по данным хромогенного ЛАЛ-теста по конечной точке Содержание эндотоксинов в вакцинной дозе (0,5 мл) препарат по патенту препарат по изобретению № образца ЭЕ № образца ЭЕ 1 2531,00 1 4,99 2 2820,00 2 0,90 3 3060,00 3 0,63

Все результаты хромогенного ЛАЛ-теста подтверждены в испытаниях на пирогенность на кроликах.

Таблица 2 Антигенная структура коклюшных препаратов по данным ммуноферментного анализа Препарат КТ1 ФГА2 ПРН3 Агг24 Агг35 Цельноклеточный компонент АКДС-вакцины + + + + + Бесклеточный препарат по изобретению + + + + + 1. КТ - коклюшный анатоксин; 2. ФГА - филаментозный гемагглютинин; 3. ПРН -пертактин; 4. Агг 2 - фимбриальный агглютиноген типа 2; 5. Агг 3 - фимбриальный агглютиноген типа 3

Похожие патенты RU2504399C1

название год авторы номер документа
КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ КОКЛЮША, ДИФТЕРИИ, СТОЛБНЯКА 2015
  • Николаева Алевтина Максимовна
  • Семенова Валентина Даниловна
  • Соснина Оксана Юрьевна
  • Сперанская Вера Николаевна
  • Грязнова Диана Васильевна
  • Пушкарева Елена Валентиновна
RU2596919C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ КОКЛЮША 2006
  • Казьянин Александр Викторович
  • Николаева Алевтина Максимовна
  • Семченко Андрей Викторович
  • Семёнова Валентина Даниловна
  • Увицкий Андрей Юрьевич
  • Сперанская Вера Николаевна
  • Пагнуева Лариса Юрьевна
RU2332231C2
КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ КОКЛЮША, ДИФТЕРИИ, СТОЛБНЯКА, ГЕПАТИТА В И ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ HAEMOPHILUS INFLUENZAE ТИП В 2015
  • Николаева Алевтина Максимовна
  • Семенова Валентина Даниловна
  • Сперанская Вера Николаевна
  • Соснина Оксана Юрьевна
  • Грязнова Диана Васильевна
  • Пушкарева Елена Валентиновна
RU2626532C2
АТТЕНУИРОВАННЫЕ БАКТЕРИИ BORDETELLA PERTUSSIS, ВАКЦИНА ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЛЮША 2010
  • Каратаев Геннадий Иванович
  • Синяшина Людмила Николаевна
RU2455024C1
СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ АНАТОКСИНА Bordetella pertussis 2012
  • Зайцев Евгений Михайлович
  • Бажанова Ирина Глебовна
  • Брицина Марина Васильевна
  • Мерцалова Наталия Устиновна
  • Озерецковская Мария Николаевна
  • Захарова Нинель Сергеевна
RU2514011C2
Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины 2018
  • Зайцев Евгений Михайлович
  • Бажанова Ирина Глебовна
  • Борисова Ольга Юрьевна
  • Брицина Марина Васильевна
  • Мерцалова Наталия Устиновна
  • Озерецковская Мария Николаевна
RU2689903C1
ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ АССОЦИИРОВАННЫЕ КОКЛЮШНО-ДИФТЕРИЙНО-СТОЛБНЯЧНО (АКДС)-ПОЛИОМИЕЛИТНЫЕ ВАКЦИНЫ 1997
  • Фахим Раафат Е.Ф.
  • Тэн Лэрри Ю.Л.
  • Баррето Льюис
  • Типпхавонг Джон
  • Джексон Гейл Е.Д.
RU2194531C2
Способ лиофильного высушивания аттенуированных бактерий B. pertussis, аттенуированная бактерия B. pertussis, штамм аттенуированных бактерий B. Pertussis, вакцина, лиофилизированный вакцинный препарат 2017
  • Каратаев Геннадий Иванович
  • Синяшина Людмила Николаевна
  • Сёмин Евгений Григорьевич
  • Медкова Алиса Юрьевна
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2709657C2
ТЕСТ-СИСТЕМА ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОКЛЮШНЫХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ 2015
  • Николаева Алевтина Максимовна
  • Вязникова Татьяна Владимировна
  • Афанасьева Татьяна Михайловна
RU2582959C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАТОКСИНА Bordetella pertussis 2005
  • Захарова Нинель Сергеевна
  • Бажанова Ирина Глебовна
  • Брицина Марина Васильевна
  • Мерцалова Наталия Устиновна
  • Озерецковская Мария Николаевна
  • Ермолова Елена Викторовна
  • Зайцев Евгений Михайлович
  • Валякина Татьяна Ивановна
  • Комалева Равиля Люкмановна
  • Несмеянов Владимир Андреевич
  • Андронова Татьяна Михайловна
RU2285540C2

Реферат патента 2014 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ КОКЛЮША

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша. Для этого штаммы Bordetella pertussis выращивают на казеиново-угольном агаре с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды и устанавливают в полученной суспензии концентрацию микробных клеток 60-80 ME и рН 8,4±0,1. Комплекс антигенов Bordetella pertussis экстрагируют 0,5% раствором дезоксихолата натрия и отделяют его от микробных клеток центрифугированием. Затем проводят очистку диафильтрацией от низкомолекулярных балластных примесей. Комплекс антигенов Bordetella pertussis переводят в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09 М NaCl. Дополнительную очистку проводят с помощью хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005 М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl. Очищенный комплекс антигенов Bordetella pertussis обезвреживают 0,100±0,025% формалина при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток. Данная технология позволяет получить препарат коклюшного антигенного комплекса со сниженным содержанием эндотоксинов с полноценной антигенной структурой. 1 пр., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 504 399 C1

Способ получения бесклеточной коклюшной вакцины для иммунопрофилактики коклюша, включающий выращивание культуры Bordetella pertussis на казеиново-угольном агаре с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды, установление в суспензии концентрации микробных клеток 60-80 ME и рН 8,4±0,1, экстракцию комплекса антигенов Bordetella pertussis 0,5% раствором дезоксихолата натрия, отделение его от микробных клеток центрифугированием и очистку диафильтрацией от низкомолекулярных балластных примесей, отличающийся тем, что комплекс антигенов Bordetella pertussis переводят в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09 М NaCl, а удаление эндотоксинов из комплекса антигенов Bordetella pertussis проводят с помощью хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl, после чего комплекс антигенов Bordetella pertussis обезвреживают 0,100±0,025% формалина при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2014 года RU2504399C1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ КОКЛЮША 2006
  • Казьянин Александр Викторович
  • Николаева Алевтина Максимовна
  • Семченко Андрей Викторович
  • Семёнова Валентина Даниловна
  • Увицкий Андрей Юрьевич
  • Сперанская Вера Николаевна
  • Пагнуева Лариса Юрьевна
RU2332231C2
RU 2227746 С1, 27.04.2004
US 4705686 А, 10.11.1987
US 4455297 A, 19.06.1984
PEREL'MAN E.V
et al
The use of monolaurates for removing endotoxins from preparations of cell-free pertussis vaccine // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol., 1992; (7-8), abstract.

RU 2 504 399 C1

Авторы

Николаева Алевтина Максимовна

Казьянин Александр Викторович

Семенова Валентина Даниловна

Языкова Марина Николаевна

Сперанская Вера Николаевна

Даты

2014-01-20Публикация

2012-12-06Подача