СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА Российский патент 1998 года по МПК A61K39/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методу получения туберкулезного анатоксина для специфической профилактики туберкулеза животных.

Аналогом препарата, предназначенного для активной профилактики туберкулеза, является живая вакцина БЦЖ. Однако в ветеринарной медицине ее, за редким исключением, не применяют из-за аллергизации организма животных к туберкулину и невозможности по этой причине проводить дефференциацию поствакцинальной аллергии от заболевания туберкулезом.

За прототип взят впервые разработанный способ получения туберкулезного анатоксина. Указанный способ получения туберкулезного анатоксина предусматривает детоксикацию токсических и инактивацию аллергенных свойств туберкулина формалином с последующей сорбцией препарата на гидроокиси алюминия. В качестве токсина используют смесь, состоящую из 2 г порошка туберкулина ППД/100 тыс. туберкулиновых единиц (Т.Е.) и 1 мл безальбумозного туберкулина с активностью 90-100 тыс. Т.Е. в 1 мл. Указанную смесь токсиноаллергенов микробактерий туберкулеза инактивируют 0,8-1%-ным формалином в течение 10-15 дней при 37-45^oC, проводят сорбцию на гидроокиси алюминия из расчета 1 мг окиси алюминия на 1 мл анатоксина с последующей стерилизацией при 0,8 атм в течение 20-30 мин.

Недостатками указанного способа получения туберкулезного анатоксина являются необходимость использования для усиления иммуногенных свойств препарата в качестве токсина порошка туберкулина ППД и слишком высокая, до 1% концентрация формалина, обеспечивающая тем не менее на 70-80% инактивацию токсических и аллергенных свойств смеси туберкулинов, содержащую в среднем 200 тыс. Т.Е. в 1 мл. Подкожное введение препарата как крупному рогатому скоту, так и лабораторным животным (морские свинки, кролики) с такой концентрацией формалина во многих случаях приводит к нежелательным воспалительным реакциям на месте инъекции препарата, снижающих протективный эффект иммунизации и в целом отрицательно влияющих на иммунобиологическую реактивность организма животных.

Цель изобретения - оптимизация способа изготовления туберкулезного анатоксина и повышение иммуногенной и протективной активности целевого конечного продукта.

Для достижения указанной цели используется автоклавированная нативная культуральная жидкость после двухмесячного выращивания микобактерий туберкулеза бовис на жидкой синтетической среде Курской биофабрики с активностью 100 тыс. Т.Е. в 1 мл. В указанную культуральную жидкость после отделения ее от биомассы микобактерий туберкулеза, с целью инактивации токсических и аллергенных свойств добавляли формалин 0,25-0,3%-ной концентрации и выдерживали 7-10 дней при 44-45^oC с последующей сорбцией на 3-4%-ном геле гидроокиси алюминия и отбрасыванием 50-55%-ной неактивной надосадочной жидкости.

Детоксикацию эндотоксина культуральной жидкости проводили 0,1; 0,2; 0,25; 0,3%-ной концентрацией формалина при 45^oC. Контроль за степенью инактивации аллергенных свойств туберкулезного анатоксина проводили на аллергизированных вакциной БЦЖ морских свинках путем постановки внутрикожных проб с разведениями испытуемого и контрольного, неинативируемого препаратов. В результате опытов установлено, что 0,1; 0,2 и 0,25%-ная концентрация формалина обеспечивала конечную инактивацию аллергенных свойств препарата соответственно на 30-40, 55-65 и 75-80% по сравнению с аллергенной активностью неинактивированной культуральной жидкостью. Добавление к культуральной жидкости 0,3%-ного формалина обеспечило полную инактивацию аллергенных свойств препарата, что подтверждалось отсутствием кожных реакций у аллергизированных морских свинок при наличии реакций на препарат, не подвергнутый обработке формалином.

Таким образом, было установлено, что культуральная жидкость с исходной активностью в 100 тыс. Т.Е. в 1 мл полностью инактивируется 0,3%-ной концентрацией формалина.

При определении влияния температуры на продолжительность инактивации аллергенных свойств препарата установлено, что температурный режим в 37^oC, как наиболее часто применяемый в практике биотехнологии получения анатоксинов, обеспечивал полную инактивацию аллергенных свойств культуральной жидкости 0,3%-ной концентрацией формалина на 14-й день. Повышение температурного режима на каждый градус ускоряло процесс инактивации на сутки, что подтверждалось последовательным редуцированием кожной чувствительности у аллергизированных морских свинок. Однако, начиная с 44^oC, ускорения процесса детоксикации не наблюдали. Для облегчения контроля за соблюдением температурного режима и ускорения процесса инактивации аллергенных свойств культуральной жидкости оптимальной температурой следует считать 45^oC.

Таким образом, 0,3%-ная концентрация формалина обеспечивает полную инактивацию аллергенных свойств культуральной жидкости с исходной аллергенной активностью в 100 тыс. Т.Е. в 1 мл, а повышение температуры до 45^oC ускоряет процесс инактивации до 7 дней, против 14 дней при 37^oC, как ранее было определено в прототипе.

После определения оптимального режима инактивации аллергенных и токсических свойств культуральной жидкости перед нами стоял вопрос о доведении требуемой активности конечного продукта в 200 тыс. Т.Е. в 1 мл. С учетом того, что культуральная жидкость после инактивации формалином утратила аллергенные свойства, поэтому первоначальные опытные исследования по концентрации конечного препарата провели с культуральной жидкостью, не подвергнутой обработке формалином. Решение этого вопроса было достигнуто путем сорбции туберкулопротеина культуральной жидкости на адъюванте и последующим отбрасыванием неактивной надосадочной жидкости.

Полноту сорбции туберкулопротеина на геле гидроокиси алюминия проводили путем исследования на аллергизированных морских свинках аллергенной активности отбрасываемой надосадочной жидкости и исследовании белка по методу Къельдаля. При этом было установлено, что добавление 3%-ного геля гидроокиси алюминия к культуральной жидкости в количестве 20, 25, 27, 30% к общему объему обеспечивает последовательное "истощение" аллергенной активности надосадочной жидкости соответственно на 50-60, 70-80, 80-90, 90-95% и содержание белка в ней соответственно до 0,9, 0,5, 0,2, 0,1 мг.

Таким образом установлено, что добавление 3%-ного геля гидроокиси алюминия в количестве 30% к общему объему культуральной жидкости, содержащей100 тыс. Т.Е. в 1 мл, является оптимальным, т.к. обеспечивает практически полностью сорбцию туберкулопротеина. При этом активность остающейся культуральной жидкости после отбрасывания менее 50% надосадочной жидкости находилась в пределах 180 тыс. Т.Е. в 1 мл, что было ниже, чем в прототипе, а при отбрасывании более 60% надосадочной жидкости приводило к большей потере конечного продукта, т.к. в декантированной жидкости содержалось до 0,2 мг туберкулопротеина. Следует отметить, что полностью избежать потерь туберкулопротеина при декантировании неактивной надосадочной жидкости не удается, тем не менее при отбрасывании 50-55% потери туберкулопротеина были минимальными и составляли в среднем до 0,1 мг, а выход конечного концентрированного продукта с активностью 200 тыс. Т.Е. в 1 мл составлял 97-98%.

Биохимическое исследование сорбированной культуральной жидкости показало, что в ней содержится 2,8±0,3 мг/мл белка, против 1,4 мг/мл до сорбции на адъюванте.

С учетом указанной возможности повышения активности конечного продукта путем сорбции туберкулопротеина на геле гидроокиси алюминия провели изготовление туберкулезного анатоксина.

Пример. Для получения туберкулезного анатоксина использовали нативную культуральную жидкость микобактерий туберкулеза бовис с исходной аллергенной активностью 100 тыс. Т. Е. в 1 мл. Инактивацию токсических и аллергенных свойств культуральной жидкости провели 0,3%-ной концентрацией формалина в течение 7 дней при 45^oC. Полученный анатоксин подвергли сорбции путем добавления в него 3%-ного геля гидроокиси алюминия в количестве 30% к общему объему с последующим отбрасыванием 50% надосадочной жидкости. После осаждения сорбированного анатоксина белок в надосадочной жидкости не определялся, что указывало на высокое и прочное его связывание с носителем.

Полученный целевой продукт - туберкулезный анатоксин при испытании аллергенной активности на аллергизированных морских свинках не вызывал у них ответных аллергических реакций. На внутрикожное введение гомологично аллергизированному крупному рогатому скоту сорбированного на гидроокиси алюминия туберкулезного анатоксина в дозе 0,2 мл ответных реакций также не отмечалось, при наличии кожных реакций на параллельное введение неинактивированного токсина культуральной жидкости в аналогичной дозе.

Двукратное и трехкратное подкожное введение туберкулезного анатоксина в дозе 5 мл молодняку крупного рогатого скота не индуцировало у них состояния повышенной чувствительности к туберкулину в течение 6 месяцев (срок наблюдения).

Протективный эффект противотуберкулезной иммунизации т туберкулезным анатоксином на морских свинках и приведен в табл. 1 и 2.

В опытах использовали туберкулезный анатоксин, полученный по схеме прототипа, и новый его вариант. Иммунизацию морских свинок туберкулезным анатоксином провели подкожно одно-и двукратно в дозе 1 и 2 мл соответственно. Спустя 30 дней после проведенной иммунизации лабораторных животных всех опытных и одной контрольной (интактной) групп заразили подкожно суспензией микобактерий туберкулеза штамм Валле в дозе 0,00001 мг/мл из расчета на одну морскую свинку. Наблюдение за зараженными животными провели в течение 60 дней, после чего всех оставшихся в живых морских свинок умертвили и провели детальный анализ патоморфологических изменений.

При убое животных из 1 и 2 опытных групп, единичные туберкулезные поражения, величиною с просяное зерно, находили у морских свинок, имевших местную воспалительную реакцию на прививку. Характер воспалительной реакции проявлялся через 2-3 дня после прививки в виде образования плотного, величиною с крупную горошину утолщения на месте введения препарата.

Преимущество нового способа получения туберкулезного анатоксина заключается в том, что в отличие от прототипа подкожное введение данного варианта препарата не оказало отрицательного действия на организм иммунизированных животных, тем самым усилило на 14,1-18,2% протективную и иммуногенную его активность по сравнению с прототипом. Вместе с тем новый способ получения туберкулезного анатоксина является экономически выгодным, если учесть, что в прототипе для усиления иммуногенных свойств конечного продукта требуется добавление порошка туберкулина ППД, потери которого при биофабричном производстве составляют до 80%, что во много раз повышает себестоимость целевого продукта.

Используемая литература:
1. Труды ВИЭМ, 1984, N 61, с.41-44.

2. Патент РФ N 2053791, A 61 K 39/04, 1996.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методу получения анатоксина для специфической профилактики туберкулеза животных. Способ включает детоксикацию эндотоксина микобактерий туберкулеза формалином, сорбцию на гидроокиси алюминия, стерилизацию. В качестве эндотоксина используется нативная культуральная жидкость микобактерий туберкулеза бовис с начальной аллергенной активностью 100 тыс.туберкулиновых единиц в 1 мл, детоксикация которой проводится 0,25-0,3%-ной концентрацией формалина при 44-45^oС, выдерживанием до 7 дней и сорбцией на 3-4%-ном геле гидроокиси алюминия, добавляемой из расчета 25-30% к общему объему, и отбрасывании 50-55% неактивной надосадочной жидкости. 2 табл.

Способ получения туберкулезного анатоксина, включающий детоксикацию эндотоксина микобактерий туберкулеза формалином, сорбцию на гидроокиси алюминия, стерилизацию, отличающийся тем, что в качестве эндотоксина используется нативная культуральная жидкость микобактерий туберкулеза бовис с начальной аллергенной активностью 100 тыс. туберкулиновых единиц в 1 мл, детоксикация которой проводится 0,25 - 0,3%-ной концентрацией формалина при 44 - 45^oC выдерживанием до 7 дней и сорбцией на 3 - 4%-ном геле гидроокиси алюминия, добавляемой из расчета 25 - 30% к общему объему и отбрасыванием 50 - 55% надосадочной жидкости.