СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАЧИНАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЙ АГРЕГАЦИОННОЙ ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицине, биологии и ветеринарии в области гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для ранней диагностики нарушения агрегации тромбоцитов.

Известен способ диагностики тромбоцитопатий (Шитикова А.С. Алгоритм диагностики тромбоцитопатий высвобождения. //Казанский медицинский журнал 1990, №3. - С.206-212). Имеется способ (Ермолаева Т.А., Головина О.Г., Морозова Т.В., Пономаренко В.М., Лубо-Лесинченко И.Ф. Программа клинико-лабораторного обследования больных тромбоцитопатиями. //Методические рекомендации. СПБ.: 1992. - 25 с.). Однако в данных способах не предусматривается диагностика ранней фазы начинающейся тромбоцитопатии. В этих способах не оценивается состояние агрегационной функции тромбоцитов путем суммации времени развития агрегации с физиологическими индукторами (АДФ, тромбин, коллаген и адреналин), вычисления среднего времени агрегации. На сегодняшний день аналогов способа выявления степени выраженности и направленности нарушения агрегации тромбоцитов (AT) не существует.

Целью изобретения является повышение эффективности диагностики тромбоцитопатии у людей и животных.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для исследования тромбоцитарного гемостаза у людей и животных (крупного рогатого скота) из вены берется кровь в пластиковую пробирку, затем исследуется агрегация тромбоцитов на стекле с АДФ, коллагеном, тромбином и адреналином с последующей суммацией времени развития AT и делением его на 4 - т.е. вычислением среднего времени агрегации, по величине которого можно судить о степени выраженности и направленности нарушения агрегационной функции тромбоцитов.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Взятие крови производят в утренние часы после 14-часового голодания. 9 мл крови берут из вены через толстую иглу самотеком в пробирку с цитратом натрия в соотношении 9:1 для оценки агрегации тромбоцитов. Сразу же определяется количество тромбоцитов в венозной крови.

Оценка AT осуществляется следующим способом (А.С.Шитикова. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб.: 1999. С.49-52).

Кровь забирают с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин, для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·10⁹/л). Концентрация кровяных пластинок в исходной БТП подсчитывается в камере Горяева (в 50 больших квадратах). Объемы смешиваемых БТП и БеТП определяют по формуле:

V_БеТП - объем бедной тромбоцитами плазмы,

V_БТП - объем богатой тромбоцитами плазмы,

N - счетная концентрация тромбоцитов в исходной БТП (клеток/мкл).

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят для каждого индуктора 0,02 мл плазмы и разными пипетками по 0,02 мл р-ра индуктора. В качестве агонистов применяется АДФ (0,5×10^-4М), коллаген (разведение основной суспензии 1:2), тромбин (0,125 ед/мл) и адреналин (0,5×10^-6M). Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см.

Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Реакцию повторяют 2-3 раза с каждым индуктором, находя среднее арифметическое значение.

Исследование AT с наиболее физиологическими индукторами агрегации (АДФ, коллагеном, тромбином и адреналином) с вычислением среднего времени агрегации позволяет выявить у людей и крупного рогатого скота риск развития различных тромбоцитопатий. Так, границы нормы для людей находятся между 48 с и 60 с, у новорожденных телят между 51 с и 70 с. Возможность возникновения геморрагической тромбоцитопатий у людей находится в пределах от 61 с до 70 с, у новорожденных телят от 70 с до 82 с. Риск возникновения тромбофиллической тромбоцитопатии у людей от 43 с до 48 с, у новорожденных телят от 41 с до 50 с. Манефестирование геморрагической тромбоцитопатии начинается у людей при 71 с и выше, у новорожденных телят при 83 с и выше. Тромбофиллическая тромбоцитопатия начинается при 42 с и ниже у людей и 41 с и ниже у новорожденных телят.

Внедрение данного способа ранней диагностики тромбоцитопатии у людей и крупного рогатого скота дает возможность решить ряд насущных социально-экономических проблем современности.

Ранняя диагностика тромбоцитопатии у больных позволит своевременно начинать лечение тромбофиллии или геморрагии, что сократит у этих пациентов сроки временной нетрудоспособности, профилактирует инсульты и инфаркты, уменьшит число выходов на инвалидность и снизит смертность среди разного контингента больных. В ветеринарии внедрение данного способа диагностики позволит оздоровить поголовье крупного рогатого скота, ускорит его развитие, сократит заболеваемость, увеличит привесы и удои.

Пример 1. Больная С., 46 лет, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 5 лет, ведущая здоровый образ жизни, обследована во время диспансерного осмотра по поводу артериальной гипертонии. У больной была взята кровь в пластиковую пробирку с последующим исследованием агрегационной активности тромбоцитов с АДФ, тромбином, коллагеном и адреналином. Агрегации тромбоцитов с исследуемыми индукторами была близка к норме (АДФ 38,2 с, коллаген 42,6 с, тромбин 42,0 с, адреналин 88,6 с. Вычисление среднего времени агрегации с данными индукторами выявило его значение на уровне 52,85 с, что соответствовало норме. Больной было рекомендовано и далее контролировать артериальное давление и вести здоровый образ жизни. Так, исследование AT через 12 нед. не выявило отрицательных изменений среднего времени агрегации тромбоцитов - 55,4 с.

Пример 2. Больной А., 47 лет, страдающий артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 12 лет. При обследовании у больного была взята кровь в пластиковую пробирку с последующей оценкой агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов с вычислением среднего времени агрегации.

У больного была выявлена возможность развития тромбофиллической тромбоцитопатии с повышением агрегации кровяных пластинок под влиянием ряда индукторов (АДФ 33,4 с, коллаген 35,1 с, тромбин 40,2 с, адреналин 78,0 с). Время средней агрегации у больного составило 46,6 с., что указывало на попадание больного в группу риска по развитию тромбофиллической тромбоцитопатии.

С целью нормализации агрегации тромбоцитов больному был рекомендован здоровый образ жизни с отказом от курения, приема алкоголя, нормализации режимов труда и отдыха, сна и бодрствования и введения в рацион продуктов, богатых витаминами, при стабильной нормализации артериального давления с обязательным повторным осмотром через 1 мес. Назначенные мероприятия позволили нормализовать исследуемые параметры через 1 мес, устранив риск развития тромбофиллической тромбоцитопатии и обеспечив увеличение среднего времени агрегации до 51,0 с. Дальнейшее соблюдение пациентом данных ему рекомендаций исключило возможность возникновения тромбофиллической тромбоцитопатии.

Пример 3. Больная С. 61 год, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 9 лет, обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь в пластиковую пробирку с оценкой AT. Была выявлена агрегационная активность тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 50,4 с, коллаген 39,6 с, тромбин 62,1 с, адреналин 104,7 с). Время средней агрегации тромбоцитов составило 64,2 с, что указывало на возможность возникновения геморрагической тромбоцитопатии. Больной на фоне стабильной гипотензивной терапии были назначен рибоксин 2 таб. 3 раза в день, способствующий нормализации AT в течение 1 мес. с нормализацией среднего времени агрегации - 56,8 с.

Больной было рекомендовано вести здоровый образ жизни, контролировать артериальное давление и через 3 мес повторять месячные курсы рибоксина, что позволило поддержать в последующем AT в нормальных границах.

Пример 4. Больной М., 44 года, страдающий артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 6 лет. При обследовании у больного была взята кровь в пластиковую пробирку с последующей оценкой агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов с вычислением среднего-времени агрегации.

У больного была выявлена возможность развития тромбофиллической тромбоцитопатии с повышением агрегации кровяных пластинок под влиянием ряда индукторов (АДФ 29,2 с, коллаген 32,4 с, тромбин 33,4 с, адреналин 73,0 с). Время средней агрегации у больного составило 42,0 с, что указывало на начало развития у больного тромбофиллической тромбоцитопатии.

С целью обратного развития тромбоцитопатии больному был назначен сиофор 500 мг 2 раза в день, настойчиво рекомендован здоровый образ жизни с отказом от курения, приема алкоголя, нормализацией режимов труда и отдыха, сна и бодрствования и введения в рацион продуктов, богатых витаминами, при стабильной нормализации артериального давления (квадроприл 6,21 мг 1 раз в сутки) с обязательным повторным осмотром через 1 мес. Назначенные мероприятия позволили нормализовать исследуемые параметры через 1 мес, устранив тромбофиллическую тромбоцитопатию и обеспечив увеличение среднего времени агрегации до 51,0 с. Дальнейшее соблюдение пациентом данных ему рекомендаций исключило возможность возникновения тромбофиллической тромбоцитопатии.

Пример 5. Теленок №7, возраст 5 дней от здоровой коровы второго отела с нормально протекавшей беременностью на 5-е сутки стал проявлять признаки кишечной диспепсии (понос). У теленка была взята кровь в пластиковую пробирку с оценкой AT. Была оценена агрегационная активность тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 67,2 с, коллаген 45,3 с, тромбин 70,1 с, адреналин 112,8 с). Время средней агрегации тромбоцитов составило 73,8 с., что позволило диагносцировать возможность возникновения геморрагической тромбоцитопатии. Теленку была назначена адекватная антибактериальная терапия и сделано в течение 3-х суток 3 внутривенные инъекции рибоксина 2% по 20,0 мл. На 8-е сутки диспепсия купировалась, а показатели AT нормализовались. Среднее время агрегайции 56,9 с. Дальнейший контроль AT у данного теленка не выявил нарушений.

Пример 6. Теленок №14, возраст 6 дней от здоровой коровы третьего отела, нормальной беременности на 6-е сутки жизни стал проявлять резко выраженные признаки кишечной диспепсии (понос). К 7 суткам появились явления обезвоживания. У теленка была взята кровь в пластиковую пробирку с оценкой AT. Была оценена агрегационная активность тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 35,2 с, коллаген 27,4 с, тромбин 45,3 с, адреналин 82,4 с). Время средней агрегации тромбоцитов составило 47,5 с, что позволило диагносцировать возможность развития тромбофиллической тромбоцитопатии. Теленку на фоне адекватной антибактериальной терапии и вольного питьевого режима с целью снятия обезвоживания и улучшения реологических и агрегационных функций тромбоцитов на 3 дня была назначена инфузионная терапия NaCl 0,9% - 600,0 мл/сутки с пентоксифиллином 200 мг/сутки. На 10-е сутки диспепсия купировалась, а показатели AT нормализовались. Среднее время агрегации 54,5 с. Дальнейший контроль AT у данного теленка не выявил нарушений.

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для ранней диагностики нарушения агрегации тромбоцитов. Сущность способа заключается в том, что у людей и животных берут кровь из вены для исследования агрегации тромбоцитов на стекле с АДФ, коллагеном, тромбином и адреналином с последующим вычислением среднего времени агрегации тромбоцитов, по значению которого определяют нормальное функционирование тромбоцитов, геморрагическую тромбоцитопатию, тромбофилическую тромбоцитопатию, а также риск возникновения указанных нарушений. Техническим результатом является повышение эффективности диагностики тромбоцитопатии у людей и животных. 10 з.п. ф-лы.

1. Способ определения состояния агрегационной функции тромбоцитов с использованием индукторов агрегации, отличающийся тем, что на предметное стекло наносят по 0,02 мл стандартизированной плазмы обследуемого и по 0,02 мл раствора физиологических индукторов агрегации, в качестве которых используют АДФ, коллаген, тромбин и адреналин, определяют время агрегации для каждого индуктора, вычисляют среднее время агрегации и при его значении выше нормы состояние агрегационной функции тромбоцитов носит характер геморрагической тромбоцитопатии, а при значении ниже нормы - тромбофилической тромбоцитопатии.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нормальное среднее время агрегации у людей составляет от 48 до 60 с.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что при значении среднего времени агрегации 61-70 с определяют риск геморрагической тробоцитопатии.4. Способ по п.2, отличающийся тем, что при значении среднего времени агрегации выше 70 с определяют начало геморрагической тромбоцитопатии.5. Способ по п.2, отличающийся тем, что при значении среднего времени агрегации от 43 до 48 с определяют риск тромбофилической тромбоцитопатии.6. Способ по п.2, отличающийся тем, что при значении среднего времени агрегации ниже 43 с определяют начало тромбофилической тромбоцитопатии.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что нормальное среднее время агрегации у новорожденных телят составляет от 51 до 70 с.8. Способ по п.7, отличающийся тем, что при значении среднего времени агрегации от 70 до 82 с определяют риск геморрагической тробоцитопатии.9. Способ по п.7, отличающийся тем, что при значении среднего времени агрегации выше 82 с определяют начало геморрагической тромбоцитопатии.10. Способ по п.7, отличающийся тем, что при значении среднего времени агрегации 41-50 с определяют риск тромбофилической тромбоцитопатии.11. Способ по п.7, отличающийся тем, что при значении среднего времени агрегации ниже 41 с определяют начало тромбофилической тромбоцитопатии.