СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БОЛЬНЫХ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ К ПРЕПАРАТАМ 5-АМИНОСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ (5-АСК) Российский патент 2006 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии.

Определение индивидуальной чувствительности (восприимчивости) больных к лекарственным средствам является важной проблемой в клинике внутренних болезней. Своевременное (до назначения лечения) решение этого вопроса с применением информативных и воспроизводимых методик позволит значительно повысить эффективность терапии.

Существуют способы оценки in vitro индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам, используемым в клинике внутренних болезней [1].

Однако достоверные методы прогнозирования эффективности лекарственных средств в большинстве случаев отсутствуют. Это относится и к такому тяжелому заболеванию, как язвенный колит (ЯК), имеющему неизвестную этиологию, наследственную (генетическую) предрасположенность к развитию болезни и сложный иммунный (аутоиммунный) патогенез.

Подбор лечения при этом заболевании осуществляется во многом эмпирически.

Существует группа препаратов (5-аминосалициловая кислота - 5-АСК, глюкокортикоиды, цитостатики и др.), из числа которых осуществляется выбор, определяемый тяжестью ЯК (легкий, среднетяжелый, тяжелый) и распространенностью процесса по толстому кишечнику (тотальный колит, левосторонний, дистальный колит - проктосигмоидит) [2].

Однако при использовании любого из указанных средств имеется возможность получения как положительного, так и отрицательного лечебного эффекта. Так, препараты 5-АСК показаны при дистальном или левостороннем колите в легкой и среднетяжелой формах. При этом выбор метода терапии (5-АСК или глюкокортикоиды) у пациентов с соответствующей формой поражения кишечника осуществляется с учетом результата лечения - не ранее чем через 2-3 недели после назначения препарата. В случае получения положительного эффекта лечение продолжают, при отрицательном результате производят замену лекарственного средства либо добавляют второй препарат.

Поставлена задача повышения эффективности лечения больных язвенным колитом.

Сущность метода заключается в том, что полиморфно-ядерные лейкоциты (ПМЯЛ), выделенные из периферической крови больных ЯК, инкубируют в присутствии одной из физиологических концентраций препарата 5-АСК - салофалька с определением до и после инкубации количества синтезированных клетками из экзогенной арахидоновой кислоты провоспалительных метаболитов - лейкотриена В₄ и тромбоксана В₂, играющих ключевую роль в возникновении и поддержании воспаления в толстой кишке.

Способ осуществляется следующим образом.

Критериями включения является наличие язвенного колита, доказанного клинико-лабораторными, рентгенологическими, эндоскопическими и гистологическими методами.

Критериями исключения служат сопутствующая патология (острые или хронические заболевания в стадии обострения), прием лекарственных препаратов, особенно производных 5-АСК и глюкокортикоидов (в течение последних 2 недель) и цитостатиков (в течение последнего месяца).

Забор крови производят из кубитальной вены в утренние часы натощак. ПМЯЛ выделяют на градиенте плотности фиколл-верографин. Полученную фракцию клеток дважды отмывают средой 199, разводят в 1 мл культуральной среды (RPMI-1640 с глутамином, 2% фетальная телячья сыворотка, гентамицин - 20 мкг/мл), доводят концентрацию клеток до 2×10⁶ мл и в этом количестве инкубируют с 0,4 мкКи [³H]-АК (218 Ки/ммоль, "Amersham") во влажной атмосфере 5% CO₂ при 37°С в течение 4 часов. Избыток [³H]-AK удаляют промыванием в среде 199. Постановку пробы осуществляют параллельно в двух вариантах. В одну из проб за 15 минут перед добавлением ионофора Са А23187 (5 мкМ) вносят салофальк (0,22×10^-3 моль/л), приготовленный на 0,02 N NaOH - концентрация считается оптимальной уровню in vivo при ЯК [3, 4]. Инкубацию продолжают в тех же условиях еще 24 часа.

Для определения спонтанного уровня продукции ЛТВ₄ и ТВ₂ ПМЯЛ инкубируют в растворе, не содержащем салофалька, обрабатывают аналогичным образом.

Реакцию синтеза останавливают добавлением 4 объемов охлажденного метанола. После центрифугирования (1800 g, 10 мин) доводят рН супернатантов до 3 раствором 1N хлористоводородной кислоты. Липиды дважды экстрагируют 2 объемами охлажденного этилацетата и выпаривают в токе азота при 40°С. Остаток ресолюбилизируют в 100 мкл смеси этанол : вода (7:3), наносят на хроматографические пластины "Silufol UV-254" и выделяют ЛТВ₄ и ТВ₂ в органической фазе смеси растворителей этилацетат : изооктан : уксусная кислота : вода (110:50:20:100) [5]. Положение ЛТВ₄ на пластине контролируют при помощи стандарта [³H]-ЛТВ₄ ("Amersham"), а положение TB₂ - с использованием соответствующего стандарта опытного завода органического синтеза и биопрепаратов (Эстония). Зоны расположения определяемых ЛТВ₄ и ТВ₂, соответствующие стандартам, элюируют метанолом, просчитывают радиоактивность на счетчике "Бета". Активность синтеза выражают в процентах метаболизированной [³H]-AK на 2×10⁶ ПМЯЛ.

В случае выявления снижения синтеза ЛТВ₄ и ТВ₂ при нагрузке ПМЯЛ in vitro салофальком менее чем на 25% следует ожидать сниженную чувствительность к препарату и, следовательно, уменьшение клинического эффекта в виде увеличения срока формирования ремиссии и/или возникновения раннего рецидива. При снижении синтеза обоих метаболитов арахидоновой кислоты под влиянием салофалька более чем на 25% можно предполагать нормальную чувствительность клеток к препарату и, как следствие этого, короткий срок формирования ремиссии и длительное ее сохранение.

При разработке способа обследовали больных с язвенным колитом. Во всех случаях имелся ЯК среднетяжелого течения, оцениваемого по соответствующим критериям (частота и дневной объем стула, степень потери массы тела, уровень снижения Hb, гипоальбуминемии, величина СОЭ). У 14 больных выявлен левосторонний колит, у 2 - дистальный, у 14 пациентов определена 2-я степень активности, у 2 - первая.

После постановки проб in vitro всем больным назначается салофальк в начальной дозе 2 г/сут с последующим (после завершения индукционного периода) переходом на поддерживающую дозу (1 г/сут).

Сопоставление результатов теста in vitro с салофальком и данных клинико-лабораторно-эндоскопического обследования проводилось через 6 месяцев после начала лечения. Результаты теста in vitro сопоставляли со сроками наступления клинической ремиссии (по клинико-лабораторным и эндоскопическим данным) и со стойкостью ремиссии (по результатам 6-месячного мониторинга).

По клиническому течению было выделено 2 группы больных: первая (11 больных) имела следующие характеристики: 1) срок исчезновения основных симптомов от 2 до 4 недель; 2) рецидивы в течение 6 месяцев наблюдения отсутствовали; вторая группа (5 больных) со следующими характеристиками: 1) срок исчезновения клинических симптомов - от 4 до 5,5 недель; 2) количество рецидивов за 6-месячный период наблюдения - 3 (60%).

Результаты

Больные язвенным колитом, вошедшие в первую группу, с характеристиками, соответствующими хорошему эффекту лечения салофальком, характеризовались падением измеренной до начала лечения спонтанной продукции ЛТВ₄ ПМЯЛ in vitro под влиянием салофалька от 62 до 80% в сравнении с количеством, синтезируемым без препарата. Уровень снижения синтеза ТВ₂ в этих же условиях колебался от 56 до 74%.

Во второй группе пациентов с ЯК, в которой клинико-лабораторные данные свидетельствовали о более длительном (от 4 до 5,5 недель) периоде становления клинической ремиссии и/или развитии раннего рецидива, уменьшение продукции ЛТВ₄ ПМЯЛ под влиянием салофалька составило от 16 до 23,5%, а снижение ТВ₂ - от 19 до 25%.

Снижение в пробе количества синтезированных in vitro из экзогенной АК лейкотриена В₄ и тромбоксана В₂ менее чем на 25% под влиянием салофалька по сравнению с лишенной салофалька пробой свидетельствует о низкой индивидуальной чувствительности клеток к препаратам 5-АСА, что требует коррекции предполагаемого лечения: либо максимального увеличения лечебной дозы препарата (как для индукции ремиссии, так и поддерживающей), либо изначального использования других схем лечения, в том числе комбинированного.

Клинические примеры

Пример 1. Больная Н., 32 лет. История болезни №3383. Поступила в гастроэнтерологическое отделение краевой клинической больницы г. Ставрополя 9.10.2000 г. Диагноз: язвенный колит, рецидивирующий, левосторонний (катарально-эрозивный), средней тяжести, активность 1-й степени, обострение.

Жалобы на частый стул (до 8 раз в сутки) с прожилками крови, слизи, общую слабость, метеоризм, тенезмы. Болеет в течение 9 лет. Заболевание возникло после родов, когда участился стул до 10 раз в сутки, появилась примесь крови в кале. После курса базисной терапии на протяжении последних 7 лет отмечалась стойкая ремиссия. Обострение возникло полтора месяца назад.

Объективно: удовлетворительного питания. Кожа и видимые слизистые розовые. Язык умеренно обложен белым налетом у корня. Тоны сердца звучные, пульс 76 в 1 минуту, ритмичный, АД 110/70 мм рт.ст. В легких дыхание везикулярное. Живот мягкий, болезненный при пальпации в левом фланке (по ходу нисходящего отдела толстого кишечника). Печень, селезенка не увеличены.

Общий анализ крови: эр. 3,5×10¹² /л, Hb 100 г/л, л. 6,6×10⁹ /л, тромб. 260×10⁹ /л, с. 63%, п. 2%, э. 2%, лимф. 31%, мон. 2%. СОЭ 20 мм/ч. Общий анализ мочи без патологии. СРВ (+), церулоплазмин 2,1 ммоль/л, сиаловые кислоты 110 ед, фибриноген 3,77 г/л. Общий белок 69 г/л, альбумины 52%, глобулины: α - 13%, β - 14%, γ - 21%. Билирубин общий 17,1 мкмоль/л, глюкоза крови 4,2 ммоль/л, АлАТ 10 Ед/л, АсАТ 16 Ед/л, сывороточное железо 11,8 мкмоль/л. Микроэлементы плазмы: Са, Na, К, Mg в норме. Холестерин 4,3 ммоль/л. Простейшие в кале не обнаружены, выявлен дисбактериоз кишечника 2-й степени. Иммунограмма: снижение CD3-клеток на 20%, повышение ФАН и уровня ЦИК.

Ирригоскопия: деформация и сглаженность складок в нисходящем отделе толстого кишечника, воспалительные полипы в проктосигмоидном отделе. Колоноскопия: в нисходящем отделе толстой кишки слизистая гиперемирована, раздражена, с единичными геморрагиями, воспалительными полипами, умеренная контактная кровоточивость. Сосудистый рисунок обеднен. Гистология: умеренная лимфоцитарно-нейтрофильная инфильтрация собственной пластинки слизистой без выраженного нарушения архитектоники железистого аппарата. Полнокровие сосудов.

Синтез in vitro ЛТВ₄ в ПМЯЛ: без салофалька 8,4% [³H]-АК/2×10⁶ клеток, с салофальком 6,57% [³H]-AK/2×10⁶ клеток. Снижение уровня синтеза - 21,8%. Синтез in vitro TB₂ в ПМЯЛ: без салофалька 9,9% [³Н]-АК/2×10⁶ клеток, с салофальком 7,6% [³H]-АК/2×10⁶ клеток. Снижение уровня синтеза - 23,2%.

Больной был назначен салофальк в суточной дозе 2 г. Клиническая симптоматика исчезла полностью только через 5 недель. На поддерживающей терапии (1 г салофалька в сутки) через 2 месяца возник рецидив.

Пример 2. Больная Б., 60 лет. История болезни №1968. Находилась в гастроэнтерологическом отделении краевой клинической больницы с 20.04 по 15.05.1998 года. Диагноз: язвенный колит, преимущественно левосторонний (катарально-эрозивный), рецидивирующее течение, средне-тяжелая форма, активность 2-й степени.

Жалобы на частый стул до 6 раз в сутки с примесью слизи и крови, тенезмы, боли в животе, общую слабость, быструю утомляемость. Болеет с 1993 года. После стационарного обследования был установлен диагноз язвенного колита, назначен сульфасалазин. Обострения в среднем 1 раз в год, последнее - в мае 1996 года.

Объективно. Рост 167 см, вес 52 кг. Телосложение правильное, пониженного питания. Кожные покровы и видимые слизистые бледные. Язык обложен белым налетом. Тоны сердца ритмичные, приглушены, ЧСС 78 в 1 минуту, АД 110/75 мм рт.ст. В легких дыхание везикулярное. Живот правильной формы, мягкий, при глубокой пальпации болезненный по ходу толстой кишки. Сигмовидная кишка плотная, болезненная, ограниченная в подвижности. Печень, селезенка не увеличены.

Общий анализ крови: эр. 3,4×10¹² /л, Hb 112 г/л, л. 3,7×10⁹ /л, с. 58%, п. 1%, лимф. 33%, мон. 8%. СОЭ 45 мм/ч. Общий анализ мочи без патологии. Общий белок 70 г/л, альбумины 45%, глобулины: α - 12%, β - 14%, γ - 29%. Глюкоза крови 4,7 ммоль/л. Билирубин общий 16,0 мкмоль/л, сывороточное железо 19,5 мкмоль/л, сиаловые кислоты 215 ед, фибриноген 4,8 г/л. Уровни сывороточного натрия, калия, магния и хлоридов в пределах нормы.

УЗИ. Печень: правая доля 128 мм, левая - 72 мм, эхогенность повышена. Воротная вена 10 мм, селезеночная - 7 мм, холедох 5 мм, желчный пузырь 48×24 мм, поджелудочная железа 26×15×17 мм, гиперэхогенная, с мелкими участками разной плотности. Селезенка 92×29 мм, ткань однородная. Ирригоскопия: язвенный колит, поражение нисходящего отдела и части поперечной ободочной кишки. Колоноскопия: в нисходящем отделе толстой кишки и в области ее селезеночного изгиба с захватом части поперечной ободочной кишки слизистая оболочка очагово гиперемирована, отечна, с множественными мелкими эрозиями, складки слизистой сглажены, сосудистый рисунок смазан. В просвете кишки умеренное количество слизи. Заключение: язвенный колит, преимущественно левосторонний (катарально-эрозивный), активность 2-й степени. Гистология: строма слизистой значительно инфильтрирована нейтрофилами, лимфоцитами, эозинофилами, плазматическими клетками. Отмечается незначительное уменьшение количества бокаловидных клеток, отек собственного слоя слизистой.

Результаты изучения продукции ЛТВ₄ и TB₂ ПМЯЛ in vitro: синтез in vitro ЛТВ₄ без салофалька 7,1% [³H]-AK/2×10⁶ клеток, с салофальком 5,5% [³H]-AK/2×10⁶ клеток. Снижение синтеза составило 22,5%. Синтез in vitro TB₂ без салофалька 8,6% [³H]-АК/2×10⁶ клеток, с салофальком 6,9% [³H]-AK/2×10⁶ клеток. Снижение синтеза - 19,8%.

Был назначен салофальк в суточной дозе 2 г. Клинические симптомы исчезли через 6 недель. На 4-м месяце поддерживающей терапии (1 г салофалька в сутки) возник рецидив, потребовавший увеличения суточной дозы салофалька до 3 г.

Пример 3. Больная М., 39 лет. История болезни №2328. Находилась на обследовании и лечении в клинике гастроэнтерологии с 29.05 по 18.06 2001 года. Диагноз: язвенный колит левосторонний (эрозивно-геморрагический), рецидивирующий, средней тяжести, активность 2 степени, стадия обострения.

Жалобы на частый жидкий стул (до 9 раз в сутки) с примесью крови и слизи, субфебрильную температуру, боль в животе, потерю веса 6 кг за последние 1,5 месяца, общую слабость. Болеет 10 лет. Обострения 2-3 раза в год. Получала препараты 5-АСК, микроклизмы с гидрокортизоном. Последние месяцы принимала 5 мг преднизолона (отменен около 3 недель назад).

Объективно. Удовлетворительного питания, кожные покровы и видимые слизистые бледноваты. Язык густо обложен белым налетом. Сердце, легкие без отклонений от нормы. Живот болезненный при пальпации по ходу нисходящего отдела толстой кишки. Печень, селезенка пальпаторно не увеличены.

Общий анализ крови: эр. 2,83×10¹²/л, Hb 84 г/л, л. 8,0×10⁹/л, тромб. 210×10⁹ /л, э. 3%, с. 68%, п. 4%, лимф. 20%, мон. 5%. СОЭ 20 мм/ч. Общий анализ мочи без патологии. Общий белок 74 г/л. Билирубин общий 10,65 мкмоль/л СРБ (+), сиаловые кислоты 200 ед., фибриноген 6,99 г/л, глюкоза крови 4,2 ммоль/л, АлАТ 10 Ед/л, АсАТ 16 Ед/л, сывороточное железо 11,7 мкмоль/л, кальций сыворотки 2,2 ммоль/л, калий - 4,8 ммоль/л. Иммунограмма: снижение на 32% Т-лимфоцитов, на 45% - В-лимфоцитов, увеличение ЦИК. Простейшие в кале не обнаружены, выявлен дисбактериоз кишечника 2 степени.

Ирригоскопия: кишка несколько укорочена, левая половина лишена гаустр. Контур кишки деформирован, складки сглажены. Колоноскопия: в нисходящем отделе кишки имеются единичные воспалительные полипы, геморрагии и эрозии. Слизистая рыхлая, легко кровоточит. Сосудистый рисунок отсутствует. Гистологически: обильная лимфоцитарно-нейтрофильная инфильтрация собственной пластинки с очагами деструкции. Снижение количества бокаловидных клеток, нарушение архитектоники желез.

Результаты изучения синтеза ЛТВ₄ и ТВ₂ ПМЯЛ in vitro: синтез ЛТВ₄ без салофалька 8,2% [³H]-АК/2×10⁶ клеток, с салофальком 4,9% [³H]-AK/2×10⁶ клеток. Снижение синтеза составило 40,3%. Синтез in vitro ТВ₂ без салофалька 9,0% [³H]-АК/2×10⁶ клеток, с салофальком - 6,1 [³H]-АК/2×10⁶ клеток. Снижение синтеза 32,3%.

Назначен салофальк в дозе 2 г/сут. Клинические симптомы исчезли через 3 недели. Поддерживающая терапия (1 г салофалька в сутки) была достаточной для сохранения ремиссии язвенного колита на протяжении по меньшей мере 8 месяцев наблюдения.

Как следует из приведенных клинических примеров, у двух первых больных со снижением синтеза ЛТВ₄ и ТВ₂ в полиморфноядерных лейкоцитах in vitro под влиянием салофалька, не превышающем 25%, наблюдался сравнительно продолжительный период формирования ремиссии язвенного колита и возникновение рецидива в 6-месячный срок. У пациентки М. со снижением синтеза обоих метаболитов в ПМЯЛ in vitro под влиянием салофалька более чем на 25% отмечен срок исчезновения клинических симптомов до 3 недель и длительное (более 6 месяцев) сохранение ремиссии язвенного колита.

Таким образом, использование предлагаемого метода позволит выявить феномен сниженной или сохраненной чувствительности клеток больного язвенным колитом к препаратам 5-аминосалициловой кислоты, являющимся базисным средством для лечения этого заболевания.

Исследование безопасно, инвазивные вмешательства (забор крови из вены) минимальны, доступно для профильных учреждений здравоохранения, нетрудоемко, затраты на оборудование и обучение персонала минимальные.

Источники информации

1. Рябов С.И., Ракитянская И.А., Ставская В.В., Никитина Н.А. Новые подходы к терапии больных гломерулонефритом // Тер. арх. - 1996. - №6. - С.24-27.

2. Румянцев В.Г. Диагностика и лечение неспецифического язвенного колита // Качество жизни. Медицина. - 2004. - №2(5). С.36-41.

3. Ligumsky M. Enhanced tromboxane A2 and prostacyclin production by cultured rectal mucosa in ulcerative colitis and its inhibition by steroids and sulfasalazine //J. Gastroenterol. - 1981. - Vol.81. - P.444-449.

4. Smith P.R. Prostaglandin synthetase activity in acute ulcerative colitis: effects of treatment with sulphasalazine, codeine phosphate and prednisolone // Gut. - 1979. - Vol.20. - P.802-805.

5. Salmon J.A. Extraction and thin-layer chromatography of arachidonic acid metabolites // Methods in enzymology prostaglandin's and arachidonate metabolites. - 1982. - Vol.86. - P.477-493.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии. Для определения индивидуальной чувствительности больных язвенным колитом к препаратам 5-аминосалициловой кислоты проводят пробу in vitro с определением синтеза лейкотриена B₄ и тромбоксана В₅ полиморфно-ядерными лейкоцитами при введении в инкубационную среду препарата 5-аминосалициловой кислоты и без него. В случае снижения синтеза ЛТВ₄ и ТВ₂ при нагрузке ПМЯЛ in vitro салофальком менее чем на 25% следует ожидать сниженную чувствительность к препарату и, следовательно, уменьшение клинического эффекта в виде увеличения срока формирования ремиссии и/или возникновения раннего рецидива. При снижении синтеза обоих метаболитов арахидоновой кислоты под влиянием салофалька более чем на 25% можно предполагать нормальную чувствительность клеток к препарату и, как следствие этого, короткий срок формирования ремиссии и длительное ее сохранение. Использование способа позволяет повысить эффективность лечения больных язвенным колитом.

Способ определения индивидуальной чувствительности больных язвенным колитом к препаратам 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК), включающий применение салофалька, отличающийся тем, что предварительно используют пробу с салофальком in vitro, для чего определяют синтез лейкотриена B₄ (ЛТВ₄) и тромбоксана B₂ (ТВ₂) полиморфноядерными лейкоцитами (ПМЯЛ), выделенными из периферической крови больного, до и после инкубации ПМЯЛ в присутствии физиологической концентрации препарата 5-АСК, и при уменьшении синтеза ЛТВ₄ и ТВ₂ в присутствии салофалька менее чем на 25% от синтеза без салофалька диагностируют сниженную чувствительность к препарату, а при уменьшении синтеза ЛТВ₄ и ТВ₂ более чем на 25% от синтеза без салофалька - нормальную чувствительность к препарату 5-АСК.