ШТАММ BACILLUS COAGULANS SIM-7 DSM 14043 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ L(+)-ЛАКТАТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L(+)-ЛАКТАТА Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C12P7/56 C12R1/07 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и применимо для получения оптически чистого L(+)-лактата посредством микробиологического синтеза.

Известный уровень техники

Микробиологический синтез L(+)-лактата основан на гомолактатной ферментации, дающей две молекулы лактата из одной молекулы сбраживаемой гексозы (например, глюкозы или галактозы).

Проблема промышленного химического синтеза чистого L(+)-лактата к настоящему моменту не решена и поэтому микробиологическому синтезу данного соединения нет альтернативы.

При микробиологическом синтезе L(+)-лактата с точки зрения эффективности затрат энергии решающим фактором является максимально возможная температура культивирования штамма микроба, способствующая установлению процесса ферментации без этапов высокотемпературной стерилизации оборудования и среды ферментации.

При доступных в настоящее время процессах, основанных на видах Lactobacillus, температура культивирования не превышает 45°С, что не исключает загрязнение термофильными микроорганизмами, если культивирование производится в богатых питательных средах при нестерильных условиях (J.H. Litchfield; In Advances in Applied Microbiology, Neidleman S.L., ed. Vol.42, p. 45-95, 1996). В процессах, основанных на Bacillus coagulans TB/04, оптимальная температура культивирования равняется 52°С (T. Payot, Z. Chemaly, F. Fick Enzyme and Microbial Technology, 24, р. 191-199). Недостатком в данном случае является ингибирование процесса при высоких концентрациях сахаров (свыше 7,5%), что осложняет применение данного штамма в промышленном масштабе.

Прототипом для настоящего изобретения служит штамм микроба Bacillus coagulans DSM 5196 (патент США No. 5079164; С 12 Р 7/56, C 12 R 1/07; Jungbunzlauer Aktiengesellschaft, 1992). В основанных на данном организме процессах оптимум температуры культивирования составляет 52°С. Данный организм можно культивировать при исходной концентрации сахаров до 20%. Однако данный организм способен превратить в лактат лишь 70% глюкозы или сахарозы среды выращивания, что ниже современных промышленных применений (85-90%).

Более того, Bacillus coagulans DSM 5196 не способен гидролизовать крахмал, что определяет необходимость предварительной обработки крахмала как исходного сырья (разжижения и осахаривания) в отдельном технологическом процессе.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является термофильный штамм микроорганизма, способный расти и продуцировать лактат при более высокой температуре по сравнению с описанной до настоящего времени для аналогичных процессов, который при этом более устойчив к высоким исходным концентрациям сахаров, способен гидролизовать крахмал и пригоден для получения L(+)-лактата либо из сбраживаемых моносахаридов, либо из крахмала.

Целью изобретения является термофильный штамм микроорганизма Bacillus coagulans SIM-7 DSM14043, который был выделен из перегретых зерен (пшеницы), с признаками микробной деградации. Пшеницу перемалывали, и крахмал разжижали. Полученный гидролизат с содержанием сахара 18-20% использовали при 60°С в качестве обогащенной культуры. Последующая селекция штамма микроба была достигнута с применением стандартных микробиологических способов.

Культуральные и морфологические свойства. Колонии штамма микроорганизма Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 являются круглыми, пупкообразными, блестящими, прозрачными, с гладкой поверхностью и сухим составом образованиями с диаметром 2...3 мм. Длинные грамположительные палочкоподобные клетки образуют цепи. Клетки подвижны, образуют субтерминальные овальные эндоспоры.

Физиологические и биохимические свойства. Штамм микроорганизма растет на моносахаридах глюкозе, маннозе, галактозе, фруктозе и на дисахаридах сахарозе, мальтозе, целлобиозе. Из полисахаридов он растет на крахмале. Лактоза не сбраживается. Он не способен разрушать казеин и желатин.

Он обладает сбраживающим метаболизмом. Он сбраживает глюкозу и крахмал до L(+)-лактата без образования CO₂. Образование L(-)-лактата отсутствует. Устойчив к кислороду. Проявляет положительную реакцию на каталазу и отрицательную - на цитохром с. Лишен способности образовывать индол.

Температура роста. Штамм микроорганизма растет при температуре до 65°С, а жизнеспособность спор сохраняется при 85°С, по меньшей мере, в течение 40 минут. Оптимальная температура его культивирования составляет 57°С, и он превращает сбраживаемые сахара, включая крахмал, в L(+)-лактат с высокой степенью чистоты, выход которого из метаболизированного сахара достигает 95%. Он способен расти и продуцировать L(+)-лактат при температуре до 65°С, что на 5-10°С выше, чем в случае сообщавшихся ранее штаммов.

Идентификация штамма микроорганизма как цель изобретения.

С помощью грамположительной системы идентификации микробов от компании Biolog Inc., основанной на характере метаболической активности (GP2 MicroPlate) и базе данных GP Database (версия 4.01А), штамм SIM-7 был идентифицирован с наибольшей вероятностью (99%) как вид Bacillus thermoglucosidasius. Эти данные, однако, находятся в противоречии с данными о последовательности гена 16S рРНК штамма SIM-7 (Gene Bank acc.nr. AF346895). Данные банка генов позволяют предполагать, что наиболее близкими родственниками штамма SIM-7 являются штамм Bacillus sp HC15 (АС252329) с двумя различиями, Bacillus coagulans NCDO 1761 (Х60614) с шестью различиями, Bacillus coagulans IAM 12463 (D16267) с семью различиями и Bacillus coagulans JCM2257 (D8313) с восемью различиями нуклеотидов из общего из количества 1464. В то же время Bacillus thermoglucosidasius (ABО21197) отличается по 131 проверенному нуклеотиду. Д-р Watanabe et al. [Watanabe, К., Kitamura, К., Suzuki, Y (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:2066-2073] сравнили нуклеотидные последовательности одного катаболического гена, олиго-1,6-глюкозидазы у штаммов Bacillus thermoglucosidasius KP1006 и Bacillus coagulans ATCC 7050. Общее сходство последовательностей данных белков равнялось 59% (Watanabe et al.). Как последовательность гена 16S рРНК, так и частичная нуклеотидная последовательность гена олиго-1,6-глюкозидазы штамма SIM-7 ясно показывают его принадлежность к виду Bacillus coagulans. Между нуклеотидами в положениях 643 и 1287 данного гена штаммов Bacillus coagulans ATCC 7050 и Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 имеется только два различия, причем оба ведут к замене аминокислоты, Met₃₉₉/Ile и Gln₄₀₂/His, соответственно (в соответствующих нуклеотидных последовательностях, GeneBank D78342, в положении 1244 а вместо g, а в положении 1253 t вместо а). Следовательно, штамм SIM-7 является нетипичным термофильным вариантом вида Bacillus coagulans, несмотря на общее сходство метаболизма с видом Bacillus thermoglucosidasus. Штамм Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 также не обладает бета-галактозидазной активностью и, в отличие от штамма Bacillus coagulans DSM 5196 (Kirkovits et al.), не способен расти на лактозе, но может расти на галактозе.

Микроорганизм с указанными выше свойствами был депонирован в Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH с номером регистрации DSM 14043, 08.02.2001.

Способность штамма микроорганизма расти при высокой температуре и использовать декстрины упрощает получение лактата из крахмала, давая возможность избежать осахаривания крахмала в качестве отдельной технологической стадии и тем самым сберегает глюкоамилазу, необходимую для осахаривания, и удешевляет процесс.

При ферментации частично разжиженного крахмала при температуре 57°С затраты энергии на перемешивание снижаются благодаря более низкой вязкости среды. Способность ферментировать несколько моно- и дисахаридов делает штамм пригодным для получения L(+)-лактата из сложных субстратов из сахаров или из их смеси. Если в качестве источника крахмала будет применяться зерно, то потребности штамма в минеральных и азотистых соединениях будут покрываться главным образом за счет соединений, получаемых из зерна. Штамм микроорганизма устойчив к высоким исходным концентрациям сахаров (17-20%) в среде выращивания, он накапливает глюкозу в среде выращивания, но обеспечивает накопление 13-14% лактата кальция в среде. Благодаря лучшей растворимости лактата кальция при более высокой температуре ферментации, если процесс включает Ca²⁺ для нейтрализации, имеется возможность увеличить концентрацию лактата кальция до 160-170 г·л^-1.

Способ получения L(+)-лактата из сбраживаемых сахаров и их смесей основывается на культивировании штамма микроорганизма в температурном диапазоне между 53 и 65°С при оптимуме температуры культивирования 57°С в среде, состоящей частично из сбраживаемых сахаров, включая декстрины, крахмала и других питательных веществ. В результате ферментации получаемая конечная концентрация L(+)-лактата составляет 12% с выходом 95%. Культивирование штамма микроорганизма должно производиться без высокотемпературной стерилизации оборудования и среды. При применении муки из зерна в качестве источника сахаров при ферментации потребности штамма микроорганизма в минеральных и азотистых соединениях среды выращивания будут покрываться соединениями, содержащимися в зерне.

Описание осуществлении

1. Выделение термофильного штамма микроорганизма Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043.

Штамм микроорганизма был выделен из перегретого зерна (пшеницы) с характеристиками микробной деградации. Масса пшеницы была размолота и разжижена. Полученный гидролизат крахмала с содержанием сахара 18-20% применяли в качестве обогащенной культуры при температуре 60°С. Культуру рассевали на одиночные колонии, и колонии со способностью закислять среду собирали и затем отбирали на способность гомолактатной ферментации по отсутствию образования СО₂. Образование L(+)-лактата тестировали ферментативным способом с помощью L-лактатдегидрогеназы. Из термоустойчивых, устойчивых к кислороду и продуцирующих L(+)-лактат колоний была выделена чистая культура Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043.

2. Получение L(+)-лактата

Муку тритикале (285 г) суспендировали в 1 л воды, и крахмал разжижали с помощью α-амилазы при 85°С до DE=22,5. Разжиженный крахмал превращали в сахар с помощью глюкоамилазы при 60°С. Нерастворимое волокнистое вещество и белок отделяли от осахаренного крахмала центрифугированием. К превращенному в пасту супернатанту с содержанием глюкозы 14,8 г·л^-1 добавляли до 0,6% дрожжевого экстракта и применяли в качестве среды ферментации для Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043. Образованную молочную кислоту нейтрализовали добавлением к среде ферментации карбоната кальция. рН ферментации находился между 5,3 и 6,2, температура равнялась 57°С, и встряхивание производилось со скоростью 100 циклов в минуту. При данных условиях через 98 часов ферментации была достигнута конечная концентрация L(+)-лактата 12,7%. Выход L(+)-лактата из метаболизированной глюкозы составил 95,5%.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности для получения L(+)-лактата посредством микробиологического синтеза. Штамм Bacillus coagulans SIM-7 выделен из перегретого зерна и депонирован под номером DSM 14043. Данный штамм используют в способе получения L(+)-лактата путем культивирования при температуре между 53-65°С на среде, содержащей частично сбраживаемые сахара. Изобретение позволяет получать L(+)-лактат при более высоких температурах, причем выход составляет более 95%. 2 н. и 3 з.п. ф-лы.

1. Штамм микроорганизма Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043, используемый для получения L(+)-лактата.2. Способ получения L(+)-лактата из сбраживаемых сахаров и их смесей с использованием штамма по п.1, отличающийся тем, что штамм микроорганизма культивируют при температуре между 53-65°С и среда ферментации содержит частично сбраживаемые сахара, включая декстрины и крахмал.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование штамма микроорганизма производят при температуре 57°С.4. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование штамма микроорганизма производят без высокотемпературной стерилизации оборудования и сред.5. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве источника сбраживаемых сахаров применяют муку зерна.