СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ППД-ТУБЕРКУЛИН ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/63 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лабораторным исследованиям, касается способа дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций, и может быть использовано для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Основу комплекса противотуберкулезных мероприятий составляет диагностика, основным способом которой считается туберкулиновая проба. Проблема специфичности реакций приобрела особую остроту в последние десятилетия из-за широкого распространения неспецифических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих. Так, по некоторым данным, положительные туберкулиновые реакции могут регистрироваться в более 80% хозяйств, причем в 13,3% хозяйств от крупного рогатого скота выделяли возбудителей туберкулеза, в 54,3% хозяйств - атипичные микобактерии и в 32,3% хозяйств природа аллергии к туберкулину не установлена /1/.

Для выяснения причин реагирования животных на ППД-туберкулин для млекопитающих проводят диагностический убой с дополнительным исследованием брыжеечных лимфатических узлов на наличие микобактерий и близкородственных микроорганизмов /2/.

Цель изобретения - способ дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, инфицированных бактериями из рода Corynebacterium.

Коринебактерии - род бактерий, включающий патогенные для человека, животных и растений микроорганизмы, а также сапрофитные виды. Коринебактерии представляют собой полиморфные палочки, от булавовидных или заостренных форм до коккоподобных, неподвижны за исключением нескольких сапрофитных и патогенных для растений видов, грамположительны, некислотоустойчивы, аспорогенны с зернами валютина. Микроб продуцирует экзо- и эндотоксины, обладающие гемолитическими, дермонекротическими и антигемолитическими (в отношении β-гемолизина золотистого стафилококка) свойствами. Патогенными для животных являются С.equi, С.suis, С.pyogenes и С.pseudotuberculosis (C.ovis). С.pseudotuberculosis (C.ovis) вызывают у животных псевдотуберкулез, который рассматривается как группа заболеваний с туберкулезоподобными поражениями. Коринебактерии могут персистировать в организме животных без видимых поражений. При заражении лабораторных животных болезнь характеризуется угнетением, диареей, истощением, изменением волосяного покрова, параличами и летальным исходом. Зараженные белые мыши гибнут через 2-4 дня, морские свинки и кролики - в срок от 2 до 35 дней. При вскрытии регистрируют в паренхиматозных органах и мышцах обширные очаги или мелкие фокусы, содержащие творожистую массу, в стенке кишечника - некрозы, в легких - эмфизематозные участки, увеличение печени, гиперплазию и бугристость селезенки. Наличие у коринебактерий общих с микобактериями антигенов /3/ объясняет природу положительных реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих в случае сенсибилизации коринебактериями.

Поставленная цель достигается тем, что в способе, включающем отбор патологического материала от положительно реагировавших на ППД-туберкулин для млекопитающих животных, засев на плотную яичную среду, например на среду Левенштейна-Йенсена, выращивание при температурном оптимуме, патологический материал предварительно обрабатывают 0,5% раствором препарата «Лесептик», на 2-3 день выращивания осуществляют окраску по Цилю-Нильсену с последующей идентификацией коринебактерий.

Способ осуществляется следующим образом.

Патологический материал от положительно реагировавших на ППД-туберкулин животных (брыжеечные, заглоточные, подчелюстные лимфатические узлы, кусочки органов с подозрительными на туберкулез изменениями) разрезают на кусочки размером 0,5×0,5 см, заливают 0,5% раствором препарата «Лесептик», оставляют при комнатной температуре на 30-45 минут, отмывают стерильным физиологическим раствором, растирают пестиком и засевают на плотную яичную среду, например, на среду Левенштейна-Йенсена или Финн-2. Выращивают при температуре +34°С. 2-3-дневные культуры окрашивают по Цилю-Нильсену и по морфологическим признакам колоний и клеток идентифицируют коринебактерии.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Для обоснования заявленных параметров способа изучали бактерицидное действие различных концентраций препарата «Лесептик» и экспозиций на микроорганизмы 1, 2 и 3 групп устойчивости in vivo. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, результаты испытаний значений концентрации препарата «Лесептик» ниже (0,2%) и выше (1,0%) заявленного (0,5%) позволили рекомендовать в качестве оптимальной для применения на практике заявленную концентрацию. Концентрация меньше заявленной обеспечивала бактерицидное действие относительно микроорганизмов 1 и 2 групп устойчивости, увеличение концентрации выше заявленной нецелесообразно, так как не обеспечивало повышения бактерицидного действия относительно заявленной.

Таблица 1
Бактерицидное действие препарата «Лесептик» в зависимости от концентрации и экспозицииКультураКонцентрация препарата «Лесептик»(%), экспозиция (часов)0,20,30,51,00,40,51,00,40,51,00,40,51,00,40,51,0Prot. mirabilis, №237+-----      Shig. flexneri, №170------      Е.coli, №17++----      Staph. aureus, №209+-----      Enterobac. faecalis, №4++----      Salm. tm., №18++----      M. avium,++++++++++++M. bovis (Vallee)++++++++++++M. tuberculosis (H₃₇Ra)++++++++++++Coryn.pseudotuberculosis, №2++++++++++--Coryn.pseudotuberculosis, №3++++++++++--Rhodococcus equi+++++++++++++ - рост, - отсутствие роста, пустые клетки - исследования не проводились

Пример 2. Для подтверждения эффективности дифференциации коринебактерий от быстрорастущих микобактерий, родококков и нокардий заявленным способом патологический материал от коровы, положительно реагировавшей на ППД-туберкулин для млекопитающих, без изменений, характерных для туберкулеза, разрезали на кусочки размером 0,5×0,5 см, заливали 0,5% раствором препарата «Лесептик», оставляли при комнатной температуре на 30-45 минут, отмывали стерильным физиологическим раствором, растирали пестиком и засевали на среду Левенштейна-Йенсена и выращивали при температуре +34°С. 2-3-дневные культуры окрашивали по Цилю-Нильсену. При микроскопировании выявляли некислотоустойчивые синие палочки (короткие или овальные) с розовыми или темно-синими зернами (зерна валютина), которые идентифицировали как коринебактерии и дифференцировали по морфологическим признакам от микобактерий (скорость роста при +34°С, отсутствие кислотоустойчивости), родококков (скорость роста при +34°С, форма и окраска клеток) и нокардий (отсутствие воздушных гифов и кислотоустойчивых клеток). Идентификацию подтверждали исследованием жирнокислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии (характерный спектр эфиров жирных кислот, не содержащих более 20 атомов углерода, отсутствие туберкулостеариновой кислоты, большое количество олеиновой кислоты).

Пример 3. Для подтверждения достижения технического результата - выявление инфицированности микроорганизмами рода Corynebacterium - культурами, выделенными на среде Левенштейна-Йенсена, как в примере 2, внутримышечно заражали трех морских свинок (1 мл ≈ 500 млн микробных клеток). Животные погибали в течение 3 недель. При вскрытии в паренхиматозных органах и в стенке кишечника нашли некротические очажки серовато-желтого цвета, в легких - энфизематозные участки. Селезенка увеличена, бугристая с множеством узелков, печень увеличена, бугристая пестро-желтого цвета, что указывало на токсичность культуры. Патологические изменения во внутренних органах были характерны для коринебактерий.

Пример 4. Для подтверждения осуществимости заявленного способа в неблагополучном по туберкулезу стаде от убитого теленка с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих исследовали подчелюстные, заглоточные, брыжеечные лимфатические узлы, участки тощей и подвздошной кишок, печень и селезенку в соответствии с заявленным способом, как в примере 2. При патолого-анатомическом осмотре у теленка наблюдали в брыжеечных лимфатических узлах некротические узелки величиной с мелкую фасоль. Рост колоний, идентифицированных как коринебактерии по морфологическим признакам (быстрый рост желтоватых колоний с неровными краями, синие палочки-овоиды при окраске по Цилю-Нильсену, наличие внутриклеточных зерен валюнтина, окрашенных в розовый или густо-синий цвет), регистрировали на 2 день. При дальнейшем выращивании в течение 2 месяцев при температуре +37°С роста колоний не наблюдали.

Пример 5. Для подтверждения осуществимости заявленного способа в благополучном по туберкулезу стада от убитой телки с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих исследовали подчелюстные, заглоточные, брыжеечные лимфатические узлы, участки тощей и подвздошной кишок, печень и селезенку в соответствии с заявленным способом, как в примере 2. При патологоанатомическом осмотре у животного не наблюдали патолого-анатомических поражений. Рост колоний, идентифицированных как коринебактерии по морфологическим признакам (быстрый рост желтоватых колоний с неровными краями, синие палочки-овоиды при окраске по Цилю-Нильсену, наличие внутриклеточных зерен валюнтина, окрашенных в розовый или густо-синий цвет), регистрировали на 3 день. При дальнейшем выращивании в течение 2 месяцев при температуре +37°С роста колоний не наблюдали.

Пример 6. Для подтверждения разрешающей возможности способа в неблагополучном по туберкулезу стаде у убитой с контрольно-диагностической целью коровы с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих без видимых патолого-анатомических изменений, характерных для туберкулеза, исследовали брыжеечные лимфатические узлы, как в примере 2. В течение первых 2-3 дней выращивания рост колоний отсутствовал, что указывало на отсутствие коринебактерий. Посевы продолжали выращивать при температуре +37°С. Через 2 недели выросли мелкие, блестящие колонии бледно-желтого цвета, которые окрашивали по Цилю-Нильсену и по морфологическим признакам идентифицировали как микобактерии, что подтверждали исследованием жирно-кислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. По хемотаксономическим характеристикам (наличие эфиров миколовых кислот с числом атомов углерода 22, 24, 26) микобактерии идентифицировали как М. avium.

Проведенные исследования подтвердили эффективность заявленного способа при исследованиях для выяснения причин сенсибилизации животных к туберкулину, что необходимо для оценки эпизоотической ситуации в стаде. Способ прост в осуществлении и экономически целесообразен.

Источники информации

1. Н.П.Овдиенко, A.M.Кадочкин, Н.А.Иванов, А.И.Козин и др. Выделение микобактерии и чувствительность крупного рогатого скота к туберкулинам//Ветеринария. - 1996. - №3. - С.28.

2. В.А.Созинов, В.П.Федоряка, И.Т.Нечваль, П.С.Шеверенко и др. - Роль атипичных микобактерий в эпизоотическом процессе//Ветеринария. - 1998. - №9. - С.28

3. О.А.Нестеренко, Е.И.Квасников, Т.М.Ногина. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. - Киев, 1985. - С.168-170.

Изобретение относится к лабораторным исследованиям, касается способа дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, инфицированных бактериями из рода Corynebacterium, и может быть использовано для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Для осуществления способа патологический материал от животного с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих обрабатывают 0,5% раствором препарата «Лесептик» в течение 30-45 минут, засевают на плотную яичную среду. Затем посевы выращивают при температурном оптимуме в течение трех дней с последующей окраской по Цилю-Нильсену и анализом морфологических признаков, по которым проводят идентификацию и дифференциацию коринебактерий. Способ по изобретению прост в осуществлении и эффективен при исследованиях для выяснения причин сенсибилизации животных к туберкулину. 1 табл.

Способ дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих животных, предусматривающий отбор патологического материала от положительно реагировавших на ППД-туберкулин животных, засев его на плотную яичную среду, выращивание при температурном оптимуме, идентификацию коринебактерий, обуславливающих аллергическую реакцию, по морфологическим признакам выросших колоний и дифференциацию их от микобактерий, родококков и нокардий, отличающийся тем, что патологический материал перед посевом обрабатывают 0,5%-ным раствором препарата «Лесептик» в течение 30-45 мин, а идентификацию коринебактерий и их дифференциацию проводят в первые три дня выращивания.