КОМПЛЕКСНЫЙ АЛЛЕРГЕН ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ППД-ТУБЕРКУЛИН ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2011 года по МПК A61K39/35 C07K4/04 C12R1/32 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и рекомендовано использовать для дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих.

В практике аллергических исследований на туберкулез известны многочисленные случаи, когда у реагирующих на ППД - туберкулин крупного рогатого скота, патологоанатомическими и бактериологическими методами исследования обнаружить туберкулез не удается и причина сенсибилизации остается невыясненной.

Установлено, что основной причиной проявления реакций на туберкулин у здоровых животных является сенсибилизация атипичными микобактериями, имеющими общие антигены с возбудителем туберкулеза [1, 2, 3].

Кроме того, причиной сенсибилизации макроорганизма к туберкулину могут быт нокардий и родококки, имеющие общие родоспецифические данные с микобактериями [5, 6].

Огромный интерес в этой связи представляют коринебактерии, имеющие с микобактериями общие физико-химические и биологические свойства и широко распространенные в природе [4, 10]. Имеются сообщения [6, 11] о том, что зараженные коринебактериями животные реагируют на ППД-туберкулин для млекопитающих.

Многообразие причин, способствующих сенсибилизации животных к туберкулину затрудняет дифференциальную диагностику туберкулеза, что в конечном итоге оборачивается значительным экономическим ущербом для хозяйств.

Указанное явление вызывает необходимость определения специфичности аллергии, результаты которых могут привести к повышению эффективности аллергического метода при диагностике туберкулеза животных.

Для аллергической диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота используют ППД - туберкулин для млекопитающих, для получения которой M.bovis, штамм №8, выращивают на среде Сотона, в течение 2-х месяцев [8]. Дифференциацию сенсибилизации вызванной птичьим видом микобактерии проводят в симультанной пробе, с использованием очищенного туберкулина для птиц и ППД-туберкулина для млекопитающих. Туберкулин для птиц готовят из M.avium (штамм №2282), и по разнице интенсивности реакций определяют причину сенсибилизации.

Известны аллергены, полученные из нокардий и родококков [5], которые в составе комплексного аллергена повышают эффективность симультанной пробы с ППД-туберкулином при дифференциации неспецифических реакций. Кроме того, аллерген из N.asteroides используется для аллергической диагностики нокардиоза.

По технической сущности близким к заявляемому аллергену является комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ), состоящий из M.scrofulaceum №12-С и M.intracellulare №13-Н [8]. Для получения аллергена культуру выращивают на синтетической среде Сотона, осаждают белок трихлоруксусной кислотой и переосаждают сернокислым аммонием. В дальнейшем для удаления солей проводят диализ через целлофановую оболочку против обессоленной воды.

Содержание единиц (ЕД.) в растворе белка каждого вида определяют на зараженных гамологичными микобактериями морских свинках в сравнении с препаратами известной активности. Полученные таким образом моноаллергены смешивают в равных количествах по содержанию единиц. Несмотря на выраженные дифференцирующие свойства в сравнении с туберкулином для птиц, комплексный аллерген из атипичных микобактерий имеет и существенный недостаток: эффективность зависит от степени родства микобактерий, вызвавших сенсибилизацию и микобактерий, использованных для изготовления аллергена[9].

Целью настоящего изобретения является повышение эффективности дифференциации аллергических реакций в симультанной пробе с КАМ за счет расширения его антигенной структуры.

Указанная цель достигается тем, что в состав комплексного аллергена из атипичных микобактерий, содержащего антигены из M.scrofulaceum №12-С и M.intracellulare №13-Н, вносится антиген из коринебактерий (Corinebacterium xerosis N1911).

Сопоставительный анализ состава аллергенов позволяет сделать вывод, что заявляемый аллерген существенно отличается от известного содержанием большего количества аллергенов за счет введения коринебактериозного аллергена. Таким образом, заявляемый аллерген существенно отличается от прототипа и поэтому соответствует критерию «новизна».

Для изготовления аллергена культуру коринебактерий (Corynebacterium xerosis N1911) выращивали на синтетической среде Сотона с добавлением смеси индивидуальных н-алканов, содержанием в цепи от 10 до 17 атомов углерода, в течение 2-х месяцев. Следует отметить, что среда Сотона нами была модифицирована и сравнительно испытана ранее. Результаты этих испытаний показали большую эффективность модифицированного варианта для выращивания коринебактерий, биомасса которых превышала контрольные серии более 2-х раз. Это позволило получить в 2 раза больше активного белка к единице объема. Колбы с культурой, где толщина слоя бакмассы достигала около 1 см, автоклавировали при 1,5 атм в течение 30 мин. Отделяли бактериальную массу фильтрацией и центрифугированием, после чего проводили осаждение белка. Из объема супернатанта в количестве 1,5 литров осаждением в изоэлектрической точке NaCl (18% концентрации, при РН 4,1) получили 3,2 гр белка. Осадок промыли, высушили, расфасовали в стеклянные флаконы и хранили в холодильнике.

Испытуемые концентрации белка (0,00005; 0,0001; 0,0002; 0,0003; 0,0004 и 0,0005 мг в 0,1 мл) получили, разбавив 0,01 мл (0,001 г) раствора 10% концентрации в стерильном физиологическом растворе (1: 1000). После перемешивания по 0,1 мл раствора внесли поочередно в пробирки с физиологическим раствором (9,9; 4,9; 2,9; 2,4; 1,9 и 19,9 мл), получив, таким образом, разведение, 1:100, 1:50, 1:30, 1:25, 1:20, и 1:200 соответственно.

Определение пороговой чувствительности аллергена проводили на 24 морских свинках, 4 - находились на контроле, через 25 дней после подкожного заражения коринебактериями, в дозе 10 мг влажной культуры в 1 мл физиологического раствора. Каждую титруемую дозу аллергена, в 0,1 мл раствора вводили внутрикожно, на депилированный участок боковой реберной поверхности. Реакцию оценивали через 32 часа после введения. При этом определяли интенсивность реакций (в мм²) по диаметру папулы, вычисляли площадь, усредненную величину интенсивности реакций, на определенную концентрацию белка. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Морские свинки контрольной группы на аллергены не реагировали. На концентрацию белка 0,00005 мг реакция была у одной морской свинки интенсивностью 1,8 мм². Во второй группе на концентрацию 0,0001 мг реагировали 2 морские свинки со средней интенсивностью 4,6 мм.

В остальном, на концентрацию белка 0,0002; 0,0003; 0,0004 и 0,0005 мг реагировали все подопытные животные, причем не установили прямой зависимости реакций от дальнейшего увеличения белка в аллергене.

Таким образом, пороговая чувствительность аллергена находится в пределах 0,00005 мг в 0,1 мл раствора, которая повышается до концентраций 0,0003 мг и в дальнейшем независимо от увеличения, интенсивность реакций снижается. Поэтому за единицу белка коринебактерий была принята доза - 0,0003 мг в 0,1 мл раствора.

Заявляемый аллерген готовили исходя из содержания белка в КАМ-е - 1350 единиц действия в 0,2 мл раствора и 0,0003 мг белка коринебактерий в 0,1 мл, которая была нами принята за единицу. Для этого взяли 20,25 мг влажной культуры Corynebacterium xerosis и смешали с 10 мл КАМ-а. Таким образом, получили 10 мл аллергена, состоящего из белков атипичных микобакгерий и коринебактерий. Для получения рабочего раствора, содержанием 15 единиц действия в 0,1 мл, на морскую свинку, 0,2 мл (1350 ед), растворили в 8,8 мл физраствора (1:45).

Испытание полученного аллергена проводили на зараженных мииобактериями (Scrofulaceum и БЦЖ) и коринебактериями (xerosis) морских свинках через 27 дней после заражения. Каждой культурой были заражены по 3 морские свинки и 3 находились на контроле.

Исследование проводили в политесте. Опытным морским свинкам на депилированный участок реберной поверхности вводили испытуемый аллерген с одной стороны и КАМ с другой в дозе 0,1 мл (10 ед). Оценку реакций проводили через 24 часа после введения. Результаты приведены в таблице 2.

Наибольшая интенсивность реакций на изучаемый аллерген была обнаружена у морских свинок, зараженных коринебактериями (117,17 мм²). Реакция на КАМ в этой группе была заметно меньше.

В остальных группах морские свинки на изучаемый аллерген реагировали менее интенсивно, хотя на КАМ реакция была выражено больше.

Таким образом, у зараженных коринебактериями морских свинок, по чувствительности комплексный аллерген с содержанием коринебактериозного аллергена превосходит КАМ в 2 раза.

Производственное испытание аллергена провели в хозяйстве, где среды коров и нетелей разного возраста постоянно выявляются реагирующие на туберкулин животные, однако результаты симультанной пробы с КАМ остаются неопределенными.

В симультанной пробе с испытуемым аллергеном исследовали 14 положительно реагирующих на туберкулин животных из 64 происследованных. При учете результатов количество положительно реагирующих (реакция интенсивнее на ППД-туберкулин) составило 1 животное, отрицательно реагирующих (реакция на испытуемый аллерген интенсивнее) - 12 голов. Количество реагирующих в равной степени составило 1 животное. Отсюда следует, что различие в интенсивности реакций на туберкулин и на испытуемый аллерген достоверно и результаты симультанной пробы считаются определенными. Поэтому с уверенностью можно констатировать, что животные данного хозяйства, у которых длительное время результаты симультанной пробы с КАМ оставались неопределенными, сенсибилизированы неспецифически.

Полученные результаты позволяют сделать вывод: чувствительность предлагаемого аллергена превосходит чувствительность прототипа (КАМ) как при выявлении зараженных коринебактериями животных, так и сенсибилизированных атипичными мииобактериями, повышая при этом эффективность симультанной пробы при дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин.

Таким образом, использование заявляемого аллергена в симультанной пробе с КАМ, позволяет предотвратить неоправданный убой животных, а также снизить расходы на проведение организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий.

Источники информации

1. Кассич Ю.Я. Изучение сенсибилизирующих и патогенных свойств атипичных микобактерий // Ветеринария - 1989. - №4. - С.13-15.

2. Марша О.Б., Тяхнас К.К. Парааллергические реакций на туберкулин и их дифференциация // Ветеринария. - 1978. - №4. С.35-38.

3. Марша О.В., Овдиенко Н.П., Ткачев-Кузмин А.В. // Туберкулез сельскохозяйственных животных. - М.: Агропромиздат, 1991. - С.28-32.

4. Нестеренко О.А. Нокардоподобные и коринеподобные бактерии. // Киев: Науково думка. 1985. 333 стр.

5 Нуратинов Р.А. Способ дифференциации диагностики туберкулеза. Патент на изобретение №2146946. - 1998 г.

6.Нуратинов Р.А. Туберкулез крупного рогатого скота в республиках Северного Кавказа и Калмыкии (эпизоотология, диагностика и меры борьбы) Дисс. док. вет. наук. Москва - 1998. - 370 стр.

7. Нуратинов Р.А., Баратов М.О., Вердиева Э.А. Комплексный аллерген для дифференциации аллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД- туберкулин для млекопитающих. Патент на изобретение №2217165. - 2003 г.

8. Шаров А.Н. и др. Препараты для диагностики туберкулеза у животных. // Курская биофабрика 100 лег. - 1996. - С.374-403.

9. Шаров А.Н. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: Повышение ее эффективности. Дисс. док. вет. наук. Москва - 1989 г.

10. Ridll M-Serologycal relationships of Nocordia, Mycobacterium, Corynebacterium and the Rhodochrous taxon with special reference to taxonomy Goteborg. /1977. - 52p.

11. Shukia R., Nafh N., Singh G. Observations on non-specific reactions to tuberculin in sheep and goats with Coiynebacterium ovis «Experientia» 1971.27. №2. - 204-205.

Таблица 1 Зависимость интенсивности реакций на аллергены от концентраций белка в растворе Концентрация белка в аллергене (мг в 0,1 мл) (Corynebacterium xerosis N1911), Интенсивность реакций, мм² M±m   -   0,00005 1,8 0,45±0,03   -     -     6,3   0,0001 - 4,6±0,8   12,4     -     21,6   0,0002 30,4 28,4±8,6   28,2     33,4     90,3   0,0003 72,4 83,2±18,9   87,2     83,1     86,3   0,0004 60,5 70,7±15,3   64,8     71,2     70,7   0,0005 50,3 60,4±13,2   64,2     58,4  

Таблица 2 Интенсивность реакций у зараженных морских свинок на изучаемый аллерген № Вид заражаемой культуры Кол-во животных в опыте Интенсивность реакций в мм² на Комплексный аллерген M±m KAM M±m     1 126,12±18,9   67,34±7,6   1 Corynebacterium xerosis 2 119,18±16,4   75,62±8,3 65,05         117,17         3 106,22±12,8   52,19±6,7                     1 97,65±11.2   99,70±11,9   2 Mycobacterium scrofulaceum 2 100,16±12.1 95,55 96,54±10,3 95,64     3 91,84±9,7   90,69±9,6       1 108,76±13,1   100,64±12,6   3 Mycobacterium БЦЖ 2 93,53±10,2 70,68 91.36±9,8 94,90     3 90,75±9,6   92,44±9,92       1 -   -   4 Контроль 2 - - - -     3 -   -  

Изобретение относится к ветеринарной медицине. В настоящее время для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота используют ППД-туберкулин для млекопитающих и КАМ и по интенсивности реакций определяют характер сенсибилизации. Известный комплексный аллерген получают осаждением белка из культур штаммов М. scrofulaceum №12-С и М. intracellulare №13-Н, в который дополнительно включают аллерген, полученный из Corynebacterium xerosis N1911, в количестве 1350 единиц действия. Наличие аллергена из коринебактерий в составе КАМ повышает эффективность симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих при дифференциации неспецифических реакций, вызванных коринебактериями. Использование заявляемого аллергена позволяет предотвратить неоправданный убой животных, а также расходы на проведения дальнейших исследовании для уточнения диагноза. 2 табл.

Комплексный аллерген для дифференциации аллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД-туберкулин для млекопитающих, полученный осаждением белка из культуры штамма M.scrofulaceum №12-С и M.intracellulare №13-Н, отличающийся тем, что дополнительно содержит аллерген из коринебактерий, полученный из культуры Corynebacterium xerosis штамм №1911, в количестве 1350 единиц действия.