КОМПЛЕКСНЫЙ АЛЛЕРГЕН ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ППД-ТУБЕРКУЛИН ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/35 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности может быть использовано при дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, обнаруживаемых у сенсибилизированного крупного рогатого скота.

В практике ветеринарной медицины для аллергической диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота используется ППД-туберкулин для млекопитающих, полученный путем осаждения белка из культуральной жидкости после 2-х месячного выращивания M. bovis 8 на синтетической среде Сотона (1). Кроме белка, содержание которого в среднем составляет 73,4%, в состав туберкулина входит 2,1% полисахаридов, 11% липидов, 1,3% нуклеиновых кислот и 12,2% других веществ и соединений (6).

Однако до настоящего времени не сконструирован туберкулин, обладающий полной специфичностью реакций, обнаруживаемых только у животных, зараженных или больных туберкулезом, вызванным микобактериями бычьего вида. Установлено, что инфицированный микобактериями птичьего вида крупный рогатый скот также реагирует на ППД-туберкулин для млекопитающих, как и больной туберкулезом или зараженный микобактериями бычьего вида. Такое положение нашло отражение и в классификации аллергических реакций на туберкулин, согласно которой их делят на специфические и неспецифические. Особенно сильное распространение у крупного рогатого скота получили неспецифические реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих при переводе птицеводства на промышленную основу. Огромное накопление M.avium во внешней среде, естественно, привело к миграции их на крупный рогатый скот, что вызвало сенсибилизацию последних к туберкулину.

Кроме того, многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных авторов установлено, что причиной проявления реакций на туберкулин у здоровых, не инфицированных возбудителем туберкулеза, животных, является сенсибилизация их атипичными микобактериями, широко распространенными в окружающей среде (3, 8).

Имеются сообщения о том, что инфицированные нокардиями, родококками и коринебактериями животные реагируют на ППД-туберкулин для млекопитающих, что еще более затрудняет дифференциальную диагностику туберкулеза (4).

В связи с этим возникла настоятельная необходимость отличения реакций, вызываемых заражением M.bovis, от таковых, возникающих сенсибилизацией M.avium. В этих целях использовали очищенный туберкулин для птиц, изготовленный из M.avium (штамм 2282) в симультанной пробе с ППД-туберкулином для млекопитающих (6). По разнице интенсивности аллергической реакции на тот или другой аллерген определяют наиболее вероятный фактор сенсибилизации макроорганизма. Если интенсивность реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих больше, чем таковая на туберкулин для птиц, то делают заключение о заражении исследуемого животного M.bovis. В обратном случае - утверждают о сенсибилизации M. avium.

Известен аллерген, изготовленный из N.asteroides, используемый для аллергической диагностики нокардиоза. Данный аллерген также используется для дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих аналогично тому, как применяют птичий туберкулин в симультанной пробе (5).

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных микобактерий (КАМ), изготовленный из M.scrofulaceum 12-С и M.intracellulare 13-Н (6). Культуры этих микобактерий выращивают на синтетической питательной среде. Осаждение белка из культурального фильтрата осуществляют трихлоруксусной кислотой (ТХУ), а очистку проводят переосаждением сульфатом аммония с последующим диализом через целлофановую оболочку для удаления сульфатов. Определяют содержание единиц (ЕД) в мл. концентрата раствора белка каждого вида этих микобактерий на морских свинках, сенсибилизированных гомологичными микобактериями в сравнении с референтными сериями этих препаратов известной активности. Полученные моноаллергены смешивают в равных количествах по содержанию единиц (ЕД).

Недостатком известного аллергена (КАМ) является узкий диапазон антигенной структуры, включающий только 2 вида атипичных микобактерий, и как следствие - низкая эффективность препарата в симультанной пробе.

Как известно, микобактерии, нокардии, родококки и коринебактерии имеют близкородственные генетические, иммунологические, хемотаксономические свойства, IV тип клеточной стенки, высокое содержание в клетках липидов, синтезируют миколовые кислоты. Установлено, что последние, так же как атипичные микобактерии, способны сенсибилизировать макроорганизм к туберкулину (5). Вместе с тем, перечисленные микроорганизмы имеют и различия в антигенной структуре. Так, например, нокардии и родококки синтезируют нокобактины и липид LCN-A, которых не обнаруживают у микобактерий. Миколовые кислоты микобактерий отличаются большим содержанием атомов углерода (С60-С90) в цепи, чем у нокардий (С36-С60) и родококков (С32-С66) и т.д. (2).

Учитывая такое положение, предпологали, что расширив антигенную структуру комплексного аллергена из микобактерий (КАМ) дополнительным внесением сенситинов из нокардий и родококков, удастся повысить чувствительность аллергена, а в конечном итоге повысить эффективность метода.

Целью изобретения является повышение эффективности дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих в симультанной пробе за счет расширения диапазона антигенной структуры комплексного аллергена.

Поставленная цель достигается тем, что комплексный аллерген из атипичных микобактерий, содержащий в качестве дифференцирующих антигены микобактерий M. scrofulaceum 12С и M.intracellulare 13-Н, дополнительно содержит в качестве дифференцирующих антигены нокардий (N.asteroides ВКМ Ас 1077) и родококков (R.bronchialis ИМВ Ас737).

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый аллерген отличается от известного введением новых компонентов, а именно - сенситинов из нокардий и родококков. Поэтому заявляемое техническое решение соответствует критерию "новизна".

Анализ данных, полученных при сравнительном испытании прототипа и заявляемого решения, показал, что последний обладает большей чувствительностью как при испытании на сенсибилизированных опытных животных, так и в производственных условиях. Таким образом, предлагаемый состав компонентов придает аллергену новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию "существенные отличия".

Для экспериментальной проверки заявляемого аллергена предварительно изготовили сенситины из нокардий и родококков. Для этого исходные культуры выращивали на среде Сотона с жидким парафином в течение 2-х месяцев при температуре 37^oС. Колбы с выращенными культурами автоклавировали при 120^oС в течение 30 минут, отделяли бакмассу сепарированием. Осаждение белка из культуральной среды осуществляли в изоэлектрической точке NaCl (pH 3,9-4,0; концентрация соли 15-20%). Осадок белка промывали, высушивали, фасовали в стеклянные флаконы и хранили в холодильнике.

Пороговую чувствительность к сенситинам определяли на зараженных нокардиями и родококками морских свинках. Для этого полученный белок (сенситин) от каждой культуры растворяли в стерильном физиологическом растворе в концентрациях от 0,00005 до 0,0005 мг. В 0,1 мл раствора 0,1 мл каждого раствора белка вводили 5-ти морским свинкам внутрикожно на депилированный участок реберной поверхности спины. Оценку реакции давали через 24 часа после введения. При этом учитывали размер папулы на месте введения препарата (в мм²). В опыте находились 60 зараженных и 12 контрольных морских свинок.

Как видно из таблицы 1, на концентрации белка в сенситине 0,00005 и 0,0001 мг в 0,1 мл раствора морские свинки не реагировали. На остальные концентрации все зараженные свинки реагировали. Средняя интенсивность реакций варьировала в группе зараженных N.asteroides от 33,0+13,02 мм² до 82,6+18,7 мм², а в группе зараженных родококками - от 41,7 + 5,1 до 50,0+9,3 мм². Не установили какого-либо повышения интенсивности реакции на сенситин в зависимости от их концентрации. Так, например, на концентрацию 0,0004 белка N. asteroides средняя интенсивность реакций составляла 82,6+18,7 мм², а на концентрацию 0,0005 - 59,5+8,6 мм². Аналогичная картина наблюдалась в группе зараженных родококками.

Таким образом, было установлено, что пороговая чувствительность к сенситинам лежит между концентрациями белка 0,0001 и 0,0002 мг в 0,1 мл раствора. Частота реагирующих на сенситин животных выравнивается с концентрации белка 0,0003 мг в 0,1 мл раствора. Дальнейшее увеличение концентрации белка в растворе до 0,0005 мг достоверно не приводило к усилению интенсивности реакций на них. Поэтому за единицу белка N.asteroides была принята навеска 0,0004 мг, a R.bronchialis - 0,0003 мг в 0,1 мл раствора, на которые получили наиболее выраженные реакции в кожной пробе.

Заявляемый аллерген готовили исходя из содержания белка в КАМ-е. Для экспериментальной проверки на зараженных морских свинках аллерген готовили путем прямого смешивания 0,54 мг белка нокардий и 0,405 мг белка родококков в ампуле с 10 мл КАМ-а. При этом 0,2 мл полученного аллергена содержал по 1350 единиц действия каждого из составляющих компонентов. Для приготовления рабочего раствора (10 единиц действия для морской свинки) один мл препарата переносили в пробирку с 9 мл растворителя (физраствор). После перемешивания 2 мл из первой пробирки переносили во вторую с 11,5 мл растворителя. Таким образом, во второй пробирке получали раствор, содержащий в 0,1 мл 10 ЕД действия каждого компонента.

Полученный таким путем аллерген и КАМ испытали на зараженных N.scrofulaceum, N.asteroides и R.bronchialis морских свинках. Каждой культурой были заражены по 5 морских свинок и 5 находились в контроле.

Исследование каждой морской свинки проводили в политесте на депилированных участках реберной поверхности кожи. Препараты вводили внутрикожно в дозе 0,1 мл (10 БД). Оценку реакции давали через 24 часа после их введения (таблица 2).

Наибольшая интенсивность реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих была обнаружена у зараженных М.БЦЖ морских свинок. Во всех остальных группах (кроме контроля) реакция на заявляемый аллерген была интенсивнее, чем на КАМ и ППД-туберкулин. Достоверных различий в интенсивности реакций на ППД-туберкулин и КАМ во 2-й и 3-й группах не установили.

Из этих наблюдений следует: с помощью заявляемого аллергена удается довыявлять животных, инфицированных нокардиями и родококками; предлагаемый аллерген более чувствителен, чем прототип (КАМ), как при исследовании животных, сенсибилизированных атипичными микобактериями, так и нокардиями, родококками; повышается эффективность метода симультанной пробы при дифференциации неспецифических реакций на туберкулин.

Производственное испытание заявляемого аллергена провели в стаде крупного рогатого скота, в котором при ранее проведенных исследованиях выявляли реагирующих на ППД-туберкулин животных, однако результаты симультанной пробы с КАМ-м оставались неопределенными.

В симультанной пробе с заявляемым аллергеном исследовали 192 коровы. При учете результатов симультанной пробы со знаком "-" (реакция на заявляемый аллерген интенсивнее, чем на ППД-туберкулин) выявили 16 голов; со знаком "+" (реакции на ППД-туберкулин интенсивнее) - 3 головы; со знаком "=" - 3 головы. Отсюда следует, что реакции на заявляемый аллерген у животных достоверно интенсивнее, чем на ППД-туберкулин для млекопитающих. Поэтому реакции у животных на туберкулин считаются неспецифическими и не следует их убивать. Экономическая эффективность заключается в предотвращении неоправданного убоя животных, сокращении расходов на проведение специальных ветеринарно-санитарных мероприятий.

Источники информации
1. Колесова А. И. Повышение вегетативных и вирулентных свойств производственных штаммов культур палочки туберкулеза // Тр. ВГНКИ. -1952. -Т.3. -С.73-79.

2. Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардоподобные и коринеподобные бактерии. Киев, Наукова думка. -1985. -333с.

3. Мартма О.В., Тяхнас К.К. Парааллергические реакции на туберкулин и их дифференциация // Ветеринария. -1978. - 4. -С.35-38.

4. Нуратинов Р.А. Туберкулез крупного рогатого скота в республиках Северного Кавказа и Калмыкии (эпизоотология, диагностика и меры борьбы). Дис.. . док. Вет. наук. Москва. -1998. -370 с.

5. Нуратинов Р.А. и др. Способ дифференциальной диагностики туберкулеза. Патент на изобретение 2146946. -1998.

6. Шаров А.Н. и др. Препараты для диагностики туберкулеза у животных. / Курская биофабрика 100 лет. -1996. -С.374-403.

7. Наставление по диагностике туберкулеза животных. Москва, 1986. -46 с.

8. Plum N. Geflugeltuberculose bei Saeugetieren // Druck von Kandripa Wunsch Kopengagen/ -1925.

Изобретение относится к ветеринарии. Комплексный аллерген содержит антигены атипичных микобактерий, а также антигены нокардий и родококков. При этом повышается чувствительность аллергена, за счет чего соответственно повышается экономическая эффективность применения препарата. 2 табл.

Комплексный аллерген для дифференциации аллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД-туберкулин для млекопитающих, полученный осаждением белка из культуральной среды штамма M.scrofulaceum №12-С и M.intracellulare №13-Н, отличающийся тем, что дополнительно содержит полученные осаждением из культуральной среды белки штаммов N.asteroides (ВКМ Ас 1077) и R.bronchialis (ИМВ Ас 737) в количестве 1350 единиц действия каждого.