СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА Российский патент 2006 года по МПК C07K1/14 C07K1/36 

Изобретение относится к способам адсорбционной хроматографии белков с использованием модифицированных адсорбентов и может найти применение для выделения и очистки бычьего сывороточного альбумина (БСА) из растворов в биохимии, медицине, водоочистке и других областях.

Известно использование на простейших стадиях очистки белков метода адсорбции «в объеме», позволяющего обработать большие количества материала. Метод заключается в том, что к белковому раствору добавляют адсорбент, уравновешенный подходящим буфером, размешивают суспензию в течение нескольких минут, дают адсорбенту отстояться и отфильтровывают его под вакуумом. Осадок адсорбента промывают буфером до тех пор, пока в промывных водах не будет обнаруживаться очень мало белка. Затем осадок отсасывают досуха, смешивают с элюирующим буфером, тщательно перемешивают и отфильтровывают под вакуумом. Эта операция может быть повторена, чтобы обеспечить отмывку всего десорбированного фермента. Элюцию белка с сорбента осуществляют подходящим для извлекаемого белка элюирующим буфером (Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985, с.190-196). К типичным материалам, используемым для адсорбции белков «в объеме», относятся гель фосфата кальция, ионообменники, аффинные адсорбенты, адсорбенты, модифицированные красителями, гидрофобные адсорбенты и иммуноадсорбенты.

Условием эффективного разделения присутствующих в растворе белков данным методом является то, что коэффициент распределения адсорбируемых белков должен быть очень близок к единице, а других белков, присутствующих в смеси, существенно более низким.

Подбор адсорбента с подходящими для определенного белка характеристиками, определяющими избирательность адсорбента к определенному виду белков, является одним из принципиальных моментов в очистке белков с использованием адсорбционных методов.

Так, для очистки растворов от трипсина предложен сорбент, получаемый попеременной обработкой силикагеля парами четыреххлористого титана и воды при 140-180°С, содержащий 19-22 мас.% оксида титана (а.с. СССР №601038, опубл. 05.04.1978 г.). Сорбент, содержащий на поверхности группы оксида титана, позволяет в оптимальном случае извлекать трипсин из раствора в количестве до 0,75 мг/г сорбента.

Дополнительная обработка сорбента, описанного в а.с. СССР № 601038, в парах гексахлорида вольфрама и воды при 230°С приводит к созданию на поверхности титансодержащего силикагеля пленки оксида вольфрама. Получаемый сорбент, содержащий в мас.%: оксид титана - 6-20 и оксид вольфрама - 19-30, характеризуется более высокой сорбционной емкостью в сравнении с вышеописанным сорбентом - 4,85 мг/г сорбента (а.с. СССР № 647006, опубл. 15.02.1979 г.).

Общим недостатком известных сорбентов является их неэффективность в случае выделения или разделения белков с большей, чем у трипсина, молекулярной массой, например, белков крови, из-за малой емкости по отношению к ним.

Известно применение метода аффинной хроматографии для очистки белков, который предусматривает использование специфических аффинных адсорбентов. Такие биоспецифические адсорбенты могут быть описаны общей формулой P-M-L, где Р - матрица органической или неорганической природы; М - промежуточное соединение (активатор), ковалентно связывающее матрицу с лигандом L; L - лиганд, соединение, обладающее сродством к адсорбируемому белку.

К сорбентам указанного типа относится биоспецифический адсорбент для аффинной хроматографии трипсина (а.с. СССР №777041, опубл. 07.11.1980 г.). При использовании такого адсорбента биоспецифический отбор происходит на стадии адсорбции за счет того, что выделяемый белок обладает специфическим сродством к адсорбенту благодаря его способности связывать лиганд.

Широкое применение в биохимической и иммунологической практике находит бычий сывороточный альбумин (БСА), используемый для подавления неспецифической адсорбции антител, для стабилизации антигенов, в качестве белка-маркера и т.д. Чистота используемого альбумина является одним из факторов, влияющих на качество проводимых исследований. В связи с этим разработка эффективных методов выделения и очистки БСА является актуальной задачей.

Выделяемый из плазмы бычий сывороточный альбумин может быть недостаточно гомогенным и требует доочистки известными методами, например методом аффинной хроматографии.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и технической сущности является способ выделения бычьего сывороточного альбумина из универсального буферного раствора (фосфат-ацетат-борат натрия) сорбцией на адсорбенте, представляющем собой модифицированное гидроксидом титана активированное углеродное волокно, с последующей элюцией белка с адсорбента путем заряжения адсорбента в катодную область до потенциала - 0,3 В. Используемый в способе адсорбент на основе углеродного волокна с высокоразвитой поверхностью (Актилен марки «Б»), покрытого диоксидом титана, обладает достаточно высокой адсорбционной емкостью по БСА (Шевелева И.В., Авраменко В.А., Братская С.Ю. Влияние кислотности среды и поляризации поверхности на адсорбцию альбумина углеродными волокнами. Изв. АН. Сер. химическая, 2002, №6, с.925-927).

Однако используемый в известном способе адсорбент относится к неорганическим материалам, на которые в процессе сорбции белка из буферных растворов одновременно сорбируются и ионы буфера, вследствие чего сорбционная емкость неорганических сорбентов по белку ограничивается из-за конкурентной сорбции между белком и ионами буфера. Кроме того, для таких адсорбентов характерно извлекать и присутствующие в растворе ненужные белки (продукты распада), другие макромолекулы и низкомолекулярные соединения (Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985, с.179-180), вследствие чего получение целевого белка чистым в результате адсорбции неорганическими материалами затруднено.

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего возможность выделения бычьего сывороточного альбумина из растворов в чистом виде, т.е. не загрязненного низкомолекулярными примесями.

Поставленная задача решается способом выделения и очистки БСА, включающим адсорбцию белка из растворов на модифицированном углеродном волокне с высокоразвитой поверхностью и элюцию белка в условиях катодной поляризации адсорбента, в котором, в отличие от известного способа, используют адсорбент, представляющий собой модифицированное хитозаном углеродное волокно и полученный электрохимической обработкой углеродного волокна в 0,05-0,5%-ном растворе хитозана в разбавленной соляной кислоте в присутствии NaCl в условиях поляризации в интервале потенциалов (+1,5)÷(-1,5) В относительно хлорсеребряного электрода (х.с.э.) сравнения, а элюцию белка с адсорбента проводят в условиях катодной поляризации при потенциалах (-0,3)÷(-0,9) В.

Сорбент для осуществления предлагаемого способа получают на основе углеродного волокнистого материала, в качестве которого могут быть взяты нити или текстильные полотна в виде тканей, трикотажа, войлока, нетканых полотен. Углеродное волокно помещают в качестве рабочего электрода в стандартную электрохимическую ячейку, в которую заливают 0,05-0,5%-ный раствор хитозана в разбавленной соляной кислоте, содержащий примерно 0,1 М NaCl (фоновый электролит) при соотношении Т:Ж, равном 1:(100÷1000), и подвергают катодной или анодной поляризации. При достижении заданного потенциала в интервале (+1,5)÷(-1,5) В выдерживают рабочий электрод в течение 20-180 мин. Затем рабочий электрод вынимают, промывают водой и сушат при температуре 25-120°С.

В результате такой обработки происходит формирование на поверхности пленки хитозана с изменением химической природы поверхности углеродных волокон и изменением их пористой структуры. Получаемый сорбент характеризуется высокой плотностью ионогенных групп, наличием аминогрупп с разной степенью протонирования (вследствие осаждения пленки хитозана на поверхности поляризованного волокна при разных потенциалах поляризации), что способствует образованию на поверхности адсорбента гидрофильно-гидрофобных участков.

В отличие от известного способа, в котором для выделения бычьего сывороточного альбумина используют адсорбент, относящийся к типу неорганических адсорбентов, используемый в предлагаемом способе адсорбент может быть отнесен к типичным афинным адсорбентам. Имеющие в своем составе концевые аминогруппы, потенциально способные к образованию водородных связей и электростатическим взаимодействиям, адсорбенты такого типа в большей степени способствуют связыванию белков.

Установлено, что предложенный для осуществления способа адсорбент проявляет большую избирательность в отношении бычьего сывороточного альбумина при выделении его из растворов, содержащих низкомолекулярные примеси, включая продукты распада БСА.

При этом нанесение полупроницаемой пленки хитозана придает биосовместимость адсорбенту с извлекаемым белком, что позволяет использовать адсорбент для целей очистки, не внося дополнительной вероятности денатурации белка на поверхности адсорбента при воздействиях агрессивного характера.

Адсорбент, предлагаемый для осуществления способа выделения и очистки БСА, за счет используемой углеродной матрицы обладает развитой поверхностью, достигающей 870-1000 м²/г адсорбента.

Заявляемый способ выделения и очистки бычьего сывороточного альбумина осуществляют в стандартной электрохимической ячейке следующим образом.

Навеску углеродного волокна, покрытого хитозаном, являющегося рабочим электродом, погружают в электролит, представляющий собой 0,9%-ный раствор хлорида натрия в воде (физиологический раствор), затем вносят в электролит раствор БСА и проводят адсорбцию белка «в объеме» в статических условиях. После насыщения адсорбента его промывают водой, физиологический раствор заменяют свежей порцией и осуществляют элюцию белка с адсорбента посредством изменения потенциала до величины в пределах (-0,3)÷(-0,9) В.

Указанные значения потенциалов, при которых можно осуществлять элюцию, соответствуют минимальной адсорбции белка и при этом не наблюдается деструкции извлекаемого и концентрируемого белка. В общем случае элюцию белка проводят в течение 0,5-2 часов.

На этапе элюции эффективность снятия белка с адсорбента обеспечивается за счет изменения заряда проводящего углеродного волокнистого материала при поляризации, наличия полупроницаемой пленки хитозана и повышения рН в приэлектродном слое в случае катодной поляризации. В результате достигается концентрирование белка и восстановление адсорбционной способности адсорбента.

Техническим результатом заявляемого способа является обеспечение возможности выделения бычьего сывороточного альбумина из растворов, не загрязненных низкомолекулярными примесями.

Возможность осуществления изобретения с достижением указанного технического результата демонстрируется следующими примерами.

Пример 1. В качестве адсорбента испытывают сорбционный материал на основе углеродного волокна Бусофит-Т (производства Светлогорского ПО «Химволокно», Белоруссия), подвергнутого электрохимической обработке в 0,07%-ном растворе хитозана в разбавленной HCl в присутствии 0,1 М раствора NaCl при -0,9 В.

Навеску адсорбента массой 0,0628 г помещают в золотую сетку и используют в качестве рабочего электрода в стандартной электрохимической ячейке. Рабочий электрод погружают в 0,9%-ный раствор NaCl в воде (физиологический раствор) объемом 70 мл. Затем в раствор вносят 10 мг БСА и проводят адсорбцию «в объеме» в статических условиях при перемешивании в течение 2 ч при разомкнутой электрической цепи.

После насыщения адсорбента белком отбирают 10 мл депротеинизированного раствора и определяют в нем содержание БСА методом высокоэффективной эксклюзионной хроматографии по методу Лоури. Количество адсорбированного белка определяют по разности белка в исходном растворе и после сорбции.

Количество адсорбированного белка составляет 73,3 мг БСА на 1 г адсорбента (46,4% от БСА, внесенного в раствор).

Элюцию белка осуществляют в тот же депротеинизированный раствор путем изменения потенциала модифицированного хитозаном углеродного волокна от внешнего источника тока до -0,3 В (относительно х.с.э. сравнения) и выдерживают при этом потенциале 2 ч. Элюцию БСА проводят в тот же объем для того, чтобы иметь возможность сравнить между собой исследуемые адсорбенты, так как при осуществлении промывки адсорбента после адсорбции существует вероятность смыва белка в промывные воды; кроме того, изменяется объем раствора после внесения в свежую порцию физиологического раствора влажной навески адсорбента с адсорбированным белком.

Количество десорбированного белка составляет 67% (от сорбированного БСА).

На чертеже представлены результаты хроматографического исследования исходного раствора БСА (кривая 1), раствора после адсорбции БСА на модифицированном хитозаном волокне (кривая 2) и раствора после элюции в него белка (кривая 3), колонка Shodex Asahipak GS-320H, детектирование при длине волны 280 нм. Показано наличие в исходном растворе кроме БСА низкомолекулярных примесей. После адсорбции содержание БСА в растворе уменьшается, а содержание низкомолекулярных примесей меняется незначительно, то есть в процессе адсорбции сорбируется БСА, а не примеси. При проведении элюции содержание БСА в растворе увеличивается, форма пика и время удерживания БСА не изменяются, концентрация примесей остается постоянной. Следовательно, в процессе элюции не происходит денатурации и разложения белка.

Пример 2. В качестве адсорбента испытывают сорбционный материал на основе углеродного волокна Бусофит-Т, подвергнутого электрохимической обработке в 0,07%-ном растворе хитозана в разбавленной HCl в присутствии 0,1 М раствора NaCl при +0,6 В. Навеска адсорбента - 0,1036 г, объем раствора - 90 мл.

Адсорбцию БСА проводят, как в примере 1, а элюцию - путем изменения потенциала модифицированного хитозаном углеродного волокна до -0,9 В.

Количество адсорбированного белка составляет 40,1 мг БСА на 1 г адсорбента (42,6% от БСА, внесенного в раствор). Количество десорбированного белка составляет 26,3% (от сорбированного БСА).

Пример 3. В качестве адсорбента испытывают углеродное волокно Бусофит-Т, покрытое оксидом титана (по прототипу). Навеска адсорбента - 0,1071 г, объем раствора - 70 мл. Адсорбцию и элюцию БСА проводят, как в примере 1.

Количество адсорбированного белка составляет 30 мг БСА на 1 г адсорбента (32,2% от БСА, внесенного в раствор), что существенно ниже, чем в примерах для заявленного способа. Количество десорбированного белка составляет 57,6% (от сорбированного БСА).

Пример 4. В качестве адсорбента испытывают немодифицированное углеродное волокно Бусофит-Т. Навеска адсорбента - 0,10 г, объем раствора - 70 мл. Адсорбцию и элюцию БСА проводят, как в примере 1.

Количество адсорбированного белка составляет 17,7 мг БСА на 1 г адсорбента (17,7% от БСА, внесенного в раствор), что существенно ниже, чем в примерах для заявленного способа. Количество десорбированного белка составляет 42,7% (от сорбированного БСА).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам адсорбционной хроматографии бычьего сывороточного альбумина (БСА) с использованием модифицированных адсорбентов, и может быть использовано для выделения БСА из растворов. Способ включает адсорбцию БСА на адсорбенте - модифицированном хитозаном углеродном волокне, который получают электрохимической обработкой углеродного волокна в растворе хитозана в разбавленной соляной кислоте в присутствии NaCl в условиях поляризации, а элюцию БСА проводят в условиях катодной поляризации при потенциалах (-0,3)÷(-0,9) В. Преимуществом заявленного способа является возможность выделения БСА из растворов без примесей. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ выделения и очистки бычьего сывороточного альбумина (БСА), включающий адсорбцию БСА из растворов на модифицированном углеродном волокне с высокоразвитой поверхностью и элюцию БСА в условиях катодной поляризации адсорбента, отличающийся тем, что адсорбцию ведут на адсорбенте, представляющем собой модифицированное хитозаном углеродное волокно, полученном электрохимической обработкой углеродного волокна в 0,05-0,5%-ном растворе хитозана в разбавленной соляной кислоте в присутствии NaCl в условиях поляризации в интервале потенциалов (+1,5)÷(-1,5) В относительно хлорсеребряного электрода сравнения, а элюцию БСА проводят в условиях катодной поляризации при потенциалах (-0,3)÷(-0,9) В.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию белка проводят в течение 0,5-2 ч.