СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ Российский патент 1995 года по МПК B01J20/06 

Описание патента на изобретение RU2026732C1

Изобретение относится к технологии получения сорбентов на основе твердых носителей, которые могут быть использованы в медицинской, фармацевтической, микробиологической промышленности, в биотехнологических производствах для получения новых биокатализаторов, очистки и разделения белка, ферментов и т.д.

Известен способ получения сорбента для очистки растворов от трипсина, заключающийся в попеременной обработке силикагеля парами четыреххлористого титана и воды при 140-180оС. Такая обработка приводит к созданию на поверхности силикагеля титансодержащих групп при их содержании в сорбенте 19-20 мас. % в пересчете на оксид титана. Емкость сорбента по трипсину невелика и составляет 0,75 мг/г сорбента [1].

Известен также способ получения сорбента для извлечения белков из сточных вод производства белково-витаминного концентрата, состоящий в попеременной обработке титансодержащего силикагеля парами гексахлорида вольфрама и воды при 230оС. Такая обработка приводит к созданию на поверхности титансодержащего силикагеля окиси вольфрама. Сорбент содержит, мас.%: 50-75 силикагеля. 6-20 оксида титана и 19-30 оксида вольфрама. Емкость сорбента по отношению к белку также невелика и составляет 4,84 мг/г сорбента [2].

Общий недостаток известных сорбентов - их неэффективность в случае выделения или разделения других белков, с большей молекулярной массой, например белков крови, из-за малой емкости по отношению к ним. Кроме того, недостатком указанных сорбентов является невысокая прочность пленки оксидов металлов при многократном использовании или термической стерилизации из-за ее отслаивания, что приводит к загрязнению раствора частицами сорбента. Способ экологически вреден, так как гидролиз хлорида титана и вольфрама протекает с выделением больших объемов хлористого водорода, требующего утилизации.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и назначению является способ получения сорбентов для иммобилизации ферментов путем модификации неорганических носителей (стекло, диоксид кремния и т.п.) оксидом титана (IV) или циркония [3].

По этому способу носитель обрабатывают 10-15%-ным раствором хлорида титана (IV) в соляной кислоте, который подвергают гидролизу при температуре 30оС в течение часа (или при температуре кипения в течение 3-5 ч), или нейтрализуют аммиаком. Модифицированный носитель промывают многократно водой и высушивают. Полученный сорбент в дальнейшем используют для адсорбции ферментов.

Главным недостатком такого способа получения является то, что гидроксид металла для модификации носителя, полученный при гидролизе тетрахлорида металла, осаждается в большей степени по объему раствора, образуя в основном механическую смесь гидроксида и носителя. При этом не сохраняется пористая структура носителя из-за образования объемных частиц гидроксида, в том числе и в порах носителя. Полученный по прототипу сорбент в значительной степени неустойчив по отношению к промывке водой из-за смывания частиц гидроксида металла, что, возможно, является в дальнейшем причиной нестабильности адсорбированных на поверхности белковых молекул.

Цель изобретения - создание способа получения сорбентов, обладающих повышенной стабильностью и селективностью в отношении адсорбции и иммобилизации белковых молекул, в частности белков крови.

Поставленная цель достигается способом получения сорбентов, включающим обработку носителя растворами солей титана или циркония и мочевиной в присутствии комплексообразующего агента (перекиси водорода, серной или щавелевой кислоты), образующего комплексное соединение с металлом с константой устойчивости от 103 до 1010, промывку, сушку, дополнительную термообработку модифицированного гидроксидом титана (IV) или циркония носителя при температуре 100-600оС. При этом соотношение соли металлов: мочевины : комплексообразующего агента составляет 0,002-0,5 : 0,005-2,0 : 0,05-1,0; а в качестве носителя используют макро- или мезопористый материал с размером пор от 100 до 2000 2000 .

Отличительными признаками способа являются: проведение обработки носителя растворами солей металлов и мочевины в присутствии комплексообразующего агента, образующего комплексное соединение с металлом с константой устойчивости от 103 до 1010; дополнительная термообработка модифицированного гидроокисью титана или циркония носителя при температуре 100-600оС; использование в качестве комплексообразующего агента растворов перекиси водорода, серной или щавелевой кислот и проведение смешивания солей металлов с мочевиной и комплексообразующим агентом при их мольном соотношении, равном 0,002-0,5 : 0,005-2,0 : 0,05-1,0; использование макро- или мезопористого носителя.

Способ осуществляют следующим образом.

Носитель, например макропористое стекло, макропористый силикагель или мезопористый углеродный материал, предварительно обрабатывают поочередно 1,5% -ными растворами соляной кислоты, щелочи и водой. Подготовленный таким образом носитель помещают в раствор, содержащий определенные количества реакционных компонентов - солей металлов, мочевины и комплексообразующего агента. Полученную суспензию нагревают при непрерывном перемешивании при 80-100оС в течение 2-5 ч, после чего сорбент отделяют от раствора, отмывают водой и сушат на воздухе. Далее сорбент подвергают термообработке при 100-600оС в течение 0,3-2 ч.

В качестве реакционного раствора для получения сорбента используют основной хлорид циркония или тетрахлорид титана, мочевину, а в качестве комплексообразующего агента - C2O42-, H2O2, H2SO4.

Необходимым условием образования тонкой пленки гидроксида металла на носителе является использование мочевины в качестве мягкого осадителя и комплексообразующего агента, введение которого смещает величину рН начала образования гидроокиси (рНн.о.г.) металла в область больших значений. Кроме того, используемый комплексообразователь, образующий комплексное соединение с металлом с константой устойчивости от 103 до 1010, определяет количественное соотношение металла и осадителя (мочевины). При меньшей величине константы устойчивости потребуется слишком большой избыток комплексообразующего агента для смещения рНн.о.г., а при большей величине константы устойчивости осаждение гидроокиси мочевиной может оказаться невозможным.

Образование пленок на носителях происходит при изменении концентрации металла от 0,002 до 0,5 М/л, мочевины от 0,005 до 2,0 М/л, комплексообразующего агента от 0,05 до 1,0 М/л. Использование концентраций реагентов в указанных интервалах позволяет получить сорбент, который будучи подвергнут термообработке, содержит от 1 до 5% оксида металла на единицу массы носителя.

Нанесение тонкой пленки оксида металла на макро- или мезопористый носитель позволяет сохранить размер поверхности и макропористую структуру практически неизменной и сделать сорбент пригодным для поглощения белков большой молекулярной массы. Обязательным условием является использование в качестве твердого носителя макропористого или мезопористого материала с размером пор 100-2000 100-2000 .

Поры носителя размером менее 100 100 при модифицировании оксидом титана или циркония закрываются пленкой и сорбент приобретает микропористую структуру. Вследствие больших размеров белковых молекул поверхность образующихся микропор становится недоступной для адсорбции белков и падает емкость сорбента.

Дополнительная термообработка сорбента при 100-600оС обеспечивает формирование макропористой структуры пленки при высокотемпературном старении гидроокиси.

Совокупность указанных выше признаков обеспечивает достижение нового технического результата. Установлено, что предлагаемый способ позволяет получить сорбент, обладающий селективностью в отношении глобулярных белков крови - бычьего сывороточного альбумина (ВСА, мол.масса 67000) и γ -глобулина (мол.масса 150000). Так, при использовании сорбента на основе макропористого стекла, покрытого пленкой оксида титана, полученного заявляемым способом, степень очистки раствора БСА от γ -глобулина увеличивается в 10 раз по сравнению с аналогичным сорбентом, не подвергшимся дополнительной термической обработке.

Интервал температурной обработки сорбентов на твердых носителях, модифицированных оксидом титана и циркония, обоснован экспериментально и лежит в пределах от 100 до 600oС.

Нижнее значение температуры 100оС определяется тем, что сорбент, термически обработанный при этой температуре, обеспечивает по крайней мере двукратную очистку раствора белка от примеси другого белка, а при температуре ниже 100оС эффект очистки меньше. Выше 600оС термообработка нецелесообразна вследствие незначительных степеней очистки, непроизводительных расходов электроэнергии и термической нестойкости дисперсной силикатной матрицы.

Экспериментально показано, что для достижения необходимого результата достаточное время термообработки составляет 0,3-2 ч.

Значение рН раствора, из которого проводят разделение белков, определяется природой белков и изменяется в соответствии со значением изоэлектрических точек р1, вблизи которых наблюдается максимальная адсорбция белка из раствора.

Для осуществления предлагаемого способа получения сорбентов на основе твердых носителей требуются известные выпускаемые промышленностью реагенты и технические средства для обработки носителя растворами, фильтрации, термообработки (реакционные сосуды, термостат, сушильные шкафы, муфели и т.д.).

Возможность реализации разработанного способа получения неорганических сорбентов подтверждается также примерами, описывающими последовательность и условия выполнения операций способа. Полученные образцы сорбентов на основе оксида титана и оксида циркония были испытаны на эффективность при разделении белков. Общие условия испытаний для всех примеров следующие: масса навески сорбента - 0,1 г; для разделения берут 10 мл фосфатного буферного раствора с рН = 8,5, содержащего 1 мг/мл БСА и 1 мг/мл γ -глобулина, меченного I125. Суммарное содержание белков в растворе определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, содержание γ -глобулина - радиометрически, содержание БСА - по разнице определений. Степень очистки раствора БСА от γ -глобулина оценивали по отношению концентрации γ-глобулина в растворе после обработки раствора сорбентом, приготовленным по заявляемому способу, но термически не обработанном, к концентрации γ-глобулина в растворе после обработки сорбентом, приготовленным по заявляемому способу (с дополнительной термообработкой).

Результаты испытания сорбентов в зависимости от условий термообработки приведены в табл.1.

П р и м е р ы.

Получение сорбента на основе оксида титана
Навеску макропористого стекла МПС-1000 массой 5 г, отмытого поочередной обработкой 1,5% -ными растворами кислоты, щелочи, затем водой, помещают в 0,5 л раствора с концентрацией тетрахлорида титана 0,05 М/л, мочевины 0,5 М/л, перекиси водорода 0,5 М/л. Суспензию выдерживают в термостате при 90±5оС при непрерывном перемешивании в течение 5 ч. Полученный сорбент отмывают водой, высушивают на воздухе. Далее сорбент прокаливают на воздухе при 100оС в течение 0,3 ч.

При испытании сорбента навеску сорбента массой 0,1 г помещают в 10 мл фосфатного буферного раствора с рН = 8,5, содержащего 1 мг/мл БСА и 1 мг/мл γ -глобулина, меченного I125. Сорбент выдерживают в растворе при непрерывном встряхивании в течение 5 ч. Затем сорбент отделяют от раствора и определяют суммарное содержание белков в растворе и содержание γ -глобулина. Содержание БСА находят по разнице определений.

Содержание БСА в растворе составляет 0,975 мг/мл, содержание γ -глобулина - 0,025 мг/мл, чистота раствора БСА - 97,5%. Степень очистки раствора БСА от γ -глобулина рассчитывают в сравнении к концентрации γ-глобулина в растворе после извлечения сорбентом, приготовленным без дополнительной термообработки.

Пример соответствует примеру 1 в табл.1.

Получение сорбента на основе оксида циркония.

Навеску макропористого стекла МПС-1000, массой 5 г, предварительно подготовленного, как в примере 1 (табл.1), помещают в 0,5 л раствора с концентрацией оксихлорида циркония 0,01 М/л, мочевины 0,5 М/л и щавелевой кислоты 0,5 М/л. Суспензию выдерживают в термостате при перемешивании при 90 ±5оС в течение 4 ч. Полученный сорбент отмывают водой, высушивают и подвергают термической обработке при 100оС в течение 0,3 ч.

Испытание сорбента по разделению белков проводят, как в примере 1 (табл.1).

Пример соответствует примеру 2 в табл.2.

Получение сорбента по прототипу
Навеску макропористого стекла МПС-1000 помещают в сосуд емкостью 25 мл с завинчивающейся крышкой, добавляют 10 мл 10%-ного (вес/объем) хлорида титана (IV) и прогревают смесь при 30оС в течение часа (реакционная среда - кислая). Удаляют остаток раствора хлорида титана (IV). Тщательно промывают активированный носитель дистиллированной водой. Высушивают промытый носитель при 100оС в течение ночи.

Испытание сорбента по разделению белков проводят, как в примере 1 (табл.1).

Пример соответствует примеру 12 П в табл.1.

Как следует из приведенных примеров, в сравнении с прототипом емкость (измеренная по величине абсорбции БСА при рН = 4,7) сорбентов, полученных по заявляемому способу, возрастает. Емкости приведены в примерах 12 П, 17 П, 22 П табл.1 и 12 П табл.2 - емкости сорбентов по прототипу и в примерах 3, 14, 19 табл.1 и 3 табл.2 - по заявляемому способу.

В приведенных примерах повышение чистоты раствора белка наблюдается при использовании сорбентов, подвергнутых термической обработке в широком температурном интервале. Однако для целей практического использования пригоден сорбент, дающий по крайней мере двукратную очистку раствора от примеси другого белка.

По этой причине широкий интервал температурной обработки целесообразно ограничить нижним значением температур - 100оС (примеры 1,2,13,18 табл.1 и 1,2 табл.2). При прокаливании сорбента при температуре менее 100оС не достигается двукратной очистки раствора от примеси (примеры 10 К табл.1 и 2).

Верхний предел температурной обработки ограничен значением температуры 600оС (пример 4,5,15,20 табл.1 и 4,5 табл.2), так как повышение температуры обработки выше 600оС приводит к снижению чистоты получаемого раствора белка (примеры 6 К, 7 К табл.1 и табл.2).

Сравнение достигнутой чистоты раствора белка проводим с чистотой раствора белка, полученной при использовании сорбента, не подвергнутого термической обработке (примеры 11 С, 16 С, 21 С табл.1 и 11 С табл.2).

Продолжительность температурной обработки лежит в интервале 0,3-2 ч. При менее продолжительной термообработке сорбента наблюдается снижение чистоты раствора белка в сравнении с более длительной обработкой сорбента (примеры 1,2,4,5 табл.1 и 2).

Продолжительность температурной обработки менее 0,3 ч не позволяет достичь двукратной степени очистки белка от примеси другого белка (примеры 9 К табл.1 и 2). Более продолжительная температурная обработка сорбента не приводит к увеличению степени очистки раствора белка от примеси (примеры 8 К табл.1 и 2) и, кроме того, связана с непроизводительным расходом энергии.

Похожие патенты RU2026732C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕРОСОДЕРЖАЩЕГО УГЛЕРОДНОГО СОРБЕНТА 2001
  • Земскова Л.А.
  • Черных В.В.
  • Авраменко В.А.
  • Каплун Е.В.
RU2187362C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ГЛИЦЕРИДНЫХ МАСЕЛ 1994
  • Авраменко В.А.
  • Юхкам А.А.
  • Каплун Е.В.
  • Земскова Л.А.
  • Павлов А.Н.
RU2080915C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАЩИТНЫХ ПОКРЫТИЙ НА ВЕНТИЛЬНЫХ МЕТАЛЛАХ И ИХ СПЛАВАХ 1992
  • Яровая Т.П.
  • Гордиенко П.С.
  • Недозоров П.М.
RU2049162C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИОННОГО МАГНИТНОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ ОКСИДОВ КРЕМНИЯ И ЖЕЛЕЗА 2014
  • Панасенко Александр Евгеньевич
  • Земнухова Людмила Алексеевна
  • Ткаченко Иван Анатольевич
RU2575458C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОГО СОРБЕНТА НА ОСНОВЕ ОКСИДОВ МАРГАНЦА (III, IV) 2002
  • Земскова Л.А.
  • Глущенко В.Ю.
  • Авраменко В.А.
RU2218209C1
СОРБЕНТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ЖИДКИХ СРЕД 1997
  • Земнухова Л.А.
  • Федорищева Г.А.
  • Сергиенко В.И.
  • Донская Г.А.
  • Золина Л.И.
  • Дрожжин В.М.
RU2117527C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФТОРИРОВАННОГО УГЛЕРОДНОГО МАТЕРИАЛА 1992
  • Цветников А.К.
  • Назаренко Т.Ю.
RU2036135C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКРАШЕННЫХ ПОКРЫТИЙ НА ВЕНТИЛЬНЫХ МЕТАЛЛАХ И СПЛАВАХ 1993
  • Яровая Т.П.
  • Руднев В.С.
  • Гордиенко П.С.
  • Недозоров П.М.
RU2066716C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА 2005
  • Земскова Лариса Алексеевна
  • Шевелева Ирина Вадимовна
  • Суховерхов Святослав Валерьевич
  • Войт Алексей Владимирович
  • Сергиенко Валентин Иванович
  • Авраменко Валентин Александрович
RU2289588C2
ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM ESTINOGENUM A.KOMATSU ET S. ABE EX G. SM. - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ P И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2002
  • Балабанова Л.А.
  • Пивкин М.В.
  • Гафуров Ю.М.
  • Рассказов В.А.
RU2220198C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 026 732 C1

Реферат патента 1995 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ

Использование в медицине, фармацевтике, микробиологии, биотехнологии для выделения белков и ферментов. Сущность: отмытый от примесей носитель обрабатывают раствором, содержащим соль титана или циркония, мочевину и в качестве комплексообразующего агента C2O24

- , H2O2 , H2O4 при молярном соотношении , равном 0,002 - 0,5 : 0,005 - 2,0 : 0,005 - 1,0. Суспензию непрерывно перемешивают в течение 2 - 5 ч при 80 - 100°С, затем отделяют от раствора, промывают водой и высушивают на воздухе, после чего подвергают термообработке при 100 - 600°С в течение 0,3 - 2 ч. Носитель - неорганический макро- или мезопористый материал с размером пор - . 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

Формула изобретения RU 2 026 732 C1

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ, включающий обработку носителя растворами солей титана или циркония при повышенной температуре, промывку и сушку, отличающийся тем, что обработку ведут в присутствии мочевины и агента, образующего комплексное соединение с титаном или цирконием с константой устойчивости 103 - 1010 и сорбент дополнительно подвергают термической обработке при 100 - 600oC
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве комплексообразующего агента используют раствор перекиси водорода, серной или щавелевой кислоты.
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что обработку ведут при молярном соотношении соли металла, мочевины и комплексообразующего агента в растворе 0,002-0,5 : 0,005-2,0 : 0,05-1,0. 4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве носителя используют мезо- и макропористый материал с размером пор .

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1995 года RU2026732C1

Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
Кеннеди Д.Ф., Каброл И.М.А
Иммобилизация биокатализаторов металлохелатным методом
Иммобилизованные клетки и ферменты
Методы, /Под ред
Дж.Вудворта
М.: Мир, 1988, с
Способ обработки медных солей нафтеновых кислот 1923
  • Потоловский М.С.
SU30A1

RU 2 026 732 C1

Авторы

Василевский В.А.

Авраменко В.А.

Земскова Л.А.

Сокольницкая Т.А.

Даты

1995-01-20Публикация

1991-10-03Подача