ШТАММ БАКТЕРИЙ Azotobacter chroococcum, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ ФУНГИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ И БИОПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/65 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.

Известно, что бактериальные препараты на основе штаммов Azotobacter chroococcum обладают способностью увеличивать урожайность ряда сельскохозяйственных культур.

Так, например, препараты на основе штаммов Azotobacter chroococcum ВКПМ-6011 (патент РФ №2074158) и Azotobacter chroococcum ВКПМ-6010 (патент РФ №2074159) повышают урожайность амаранта и зеленных культур соответственно. Однако спектр действия данных препаратов ограничен только указанными культурами.

Известен штамм Azotobacter chroococcum ВКПМ-3064 (патент РФ №1703634, прототип), обладающий антагонизмом по отношению к фитопатогенным грибам и способностью к синтезу индалил-уксусной кислоты (ИУК), а препарат на его основе повышает урожайность целого ряда сельскохозяйственных культур.

Недостатком данного штамма является то, что у него отсутствует антагонизм по отношению к фитопатогенным бактериям, а препарат на его основе не эффективен для зерновых культур.

Задачей изобретения является получение нового высокопродуктивного штамма, обладающего способность к синтезу ИУК, высокой нитрогеназной активностью, широким спектром подавления фитопатогенных грибов и бактерий, способностью сохранять жизнеспособность в присутствии пестицидов, и получение биопрепарата, который повышает урожайность сельскохозяйственных культур, в том числе и зерновых, их устойчивость к различным заболеваниям и может быть использован совместно с пестицидами.

Поставленная задача решается тем, что получен штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, на основе которого создан биологический препарат, повышающий урожайность сельскохозяйственных культур (в том числе и зерновых) и их устойчивость к различным заболеваниям, и который может быть использован совместно с пестицидами.

Штамм бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях), высокая продуктивность, в том числе и на регламентных средах, высокая нитрогеназная активность, способность к синтезу ИУК, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-9029.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При выращивании на агаризованной питательной среде, имеющей состав (мас.%): КН₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - следы; раствор микроэлементов - 0,1; сахароза - 2,0; агар - 2,0, рН 6,8-7,2, при 29±1°С в течение 96 часов культура образует круглые выпуклые блестящие слизистые колонии 2-4 мм, гладкие с ровным краем, непрозрачные, тягучей консистенции, при микроскопировании мелкие палочки 1,0×2,0 мкм, встречаются кокковидные формы.

На твердой питательной среде Берка, имеющей состав (мас.%): КН₂PO₄ - 0,08; К₂HPO₄ - 0,02; MgSO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; Fe₂(SO₄)₃ - 0,001; CaSO₄ - 0,01; глюкоза - 1,0; агар - 2,0, рН 6,8-7,0 колонии прозрачные, слегка голубоватые 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, круглые, выпуклые с ровными краями. При микроскопировании мелкие палочки кокковидной формы.

При выращивании на жидкой питательной среде Федорова с мелассой (мас.%): меласса - 3,0; К₂HPO₄ - 0,03; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,05; К₂SO₄ - 0,02; Fe₂Cl₃ - 0,001; СаСО₃ - 0,5; р-р микроэлементов - 0,01; рН 6,8-7,2 при температуре 29±1°С и непрерывном перемешивании - аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, в течение 24 часов культура представляет собой жидкость; при микроскопировании клетки мелкие палочки, слабоподвижные; зрелые клетки на 48 часу роста мелкие палочки, кокковидной формы, неподвижные, образуют толстостенные цисты.

Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах 1-1,2×1,5-2,5 мкм. Реакция по Грамму - отрицательная.

На МПА и МПБ рост отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки

Мезофил, рост возможен в интервале 25-35°С, оптимальная для роста температура 29±1°С.

Аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем воздуха/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.

Возможен рост при рН 6,5-8,0, оптимально для роста рН 6,8-7,2.

Отношение к источникам углеводов.

Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, маннит, сорбозу, крахмал, декстрин, глицерин, этанол. Не усваивает ксилозу, арабинозу, лактозу, целлюлозу.

Отношение к источникам азота.

Хорошо растет на безазотистых средах, а также на средах с добавлением мелассы и (NH₄)₂SO₄. В качестве источников азота используют нитраты, соли аммония и некоторые аминокислоты.

Отношение к фитопатогенным грибам и бактериям.

Подавляет рост грибов Alternaria sp., Pythium de Baryanum, Fusarium oxysporum, Fusarium vasinfectum, Fusarium moniliforme, Fusarium lini, Cladosporium sp., Scolecotrychum sp., Helmintosporium sativum, Botrytis sp., Verticillium dahliae и бактерий Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Septoria graminum, Actinomyces sp. Активность определяли методом агаровых блочков (Егоров Н.С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М., "Высшая школа", 1965, с.131.) через 3-6 суток роста тест-культур на диагностических средах (табл.1).

Штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 хранится на твердой питательной среде следующего состава, мас.%: КН₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; меласса - 3,0; агар - 2,0. Температура выращивания 29±1°С, продолжительность выращивания 72-96 ч.

Штамм хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре 4±2°С до 2-х лет.

Таблица 1.
Спектр антагонистической активности штамма Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029Тест-культураЗона подавления роста, ммAlternaria sp.9Botrytis sp.11Cladosporium sp.4Fusarium brassicae12Fusarium lini9Fusarium moniliforme6Fusarium oxysporum7Fusarium vasinfectum9Helmintosporium sativum6Pythium de Baryanum12Scolecotrychum sp.8Verticillium dahliae7Actinomyces sp.6Puccinia triticina6Rhizoctonia sp.10Septoria graminum7Phytophtora infestans4

Таким образом, получен штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, имеющий следующие характерные особенности:

- хороший рост на производственных средах в условиях глубинной ферментации;

- широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры в почве;

- высокая нитрогеназная активность (что характеризует способность штамма к азотфиксации);

- способность к синтезу ИУК (которая относится к фитогормонам и оказывает положительное влияние на рост растений);

- способность сохранять активность при длительном хранении без лиофилизации при температуре 2-4°С.

Кроме того, нами показано (пример 4), что полученный штамм способен сохранять свою жизнеспособность в присутствии ряда пестицидов, что позволяет использовать их в одной баковой смеси с препаратом, в основе которого лежит полученный штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029.

Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям получен путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Azotobacter chroococcum ВКПМ В-9029, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Федорова с мелассой в течение 24-36 часов, а вторую - на той же среде в течение 48-60 часов, ферментации ведут при температуре 29±1°, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение биологического препарата на основе штамма Azotobacter chroococcum ВКПМ В-9029.

Стерильную жидкую питательную среду состава, мас.%: KH₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; Н₃ВО₃ - 0,0005; меласса - 3,0; рН 6,8-7,2 в инокуляторе засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в течение 30 часов при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту.

Полученной посевной культурой засевают ферментер с предварительно простерилизованной жидкой питательной средой, имеющей состав, мас.%: КН₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₃(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; Н₃ВО₃ - 0,0005; меласса - 3,0; рН 6,8-7,2 из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивание проводят при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту. Продолжительность выращивания 48 часов. Получают вязкую жидкую культуру с титром 20 млрд./мл, нитрогеназной активностью 2135 мкг N₂ и содержанием ИУК 12,1 мкг/мл.

В качестве готового продукта используют вязкую жидкую культуру Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 с рН 7,4-7,8 и активностью КОЕ не менее 5 млрд./мл.

Показано, что готовый продукт сохраняет свою активность в течение 6 месяцев при температуре от +4 до +20°С.

Готовый продукт фасуют в заранее простерилизованные канистры по 10 л и сдают на склад.

Пример 2. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур.

Препарат, полученный по примеру 1, применяли для проведения испытаний в открытом грунте (площадь обработки 9 га из расчета 200 мл/га)

- на яровой пшенице и сахарной свекле в Курском НИИАПП (опрыскивание почвы перед посевом);

- на картофеле в Брянском филиале ВНИИКХ (обработка почвы перед посевом);

- на яровой пшенице и горохе в Козангуловском ОПХ (обработка посевов в фазе кущения и обработка почвы перед посевом соответственно);

- на яровом ячмене в Краснодарском крае (обработка семян и внесение в почву)

Таблица 2.
Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культурОбрабатываемые культурыУРОЖАЙ, ц/гаПрибавка урожая контрольпрепаратц/га%Яровая пшеница31,235,74,514,4Сахарная свекла279,0349,070,025,1Яровой ячмень17,821,23,419,1Горох20,122,32,210,9Картофель301,0432,0131,043,5

Данные испытаний, приведенные в табл.2, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, оказывает положительное влияние на урожайность широкого ряда сельскохозяйственных культур.

Пример 3. Влияние препарата на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями.

В Козангуловском ОПХ и в Курском НИИАПП определяли влияние препарата, полученного по примеру 1, на степень поражения болезнями гороха и яровой пшеницы.

Обработку посевов проводили препаратом на площади 10 га из расчета 200 мл/га.

Результаты, приведенные в табл.3, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, подавляет развитие различных заболеваний сельскохозяйственных культур.

Таблица 3.
Влияние препарата на степень поражения гороха и яровой пшеницы различными болезнями. Яровая пшеницаГорох Бурая ржавчина, %Септориоз, %Корневые гнили %Аскохитоз, %Ржавчина %Корневые гнили, %Козангуловское ОПХКонтроль--21,013,87,210,3Препарат--6,07,36,19,1Курское НИИАППКонтроль26,546,9----Препарат10,123,3----

Пример 4. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029

Проверку влияния пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 осуществляют путем сравнения жизнеспособности штамма в стандартном рабочем растворе биологического препарата и в рабочем растворе с добавлением химического препарата (пестицида).

Для этого к 1 литру воды добавляют 0,6 мл препарата, полученного по примеру 1, и рассчитанное количество пестицида. Смесь тщательно перемешивают в течение 30 минут и определяют число жизнеспособных клеток штамма в единице объема.

Концентрацию пестицида в смеси рассчитывали исходя из рекомендуемых норм расхода при полевых обработках зерновых культур.

Результаты, приведенные в табл.4, показали, что вышеперечисленные пестициды не оказывают существенного отрицательного влияния на жизнеспособность штамма, а следовательно, препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, при проведении полевых работ может быть использован с пестицидом в одной баковой смеси.

Таблица 4.
Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029№ п/пНазвание пестицидаКонцентрация пестицида в рабочем растворе (%)Число жизнеспособных клеток (титр) в 1 мл смеси.1Контроль (Биопрепарат без пестицида)-9,3 млрд.Гербициды2Диален-супер0,274,01 млрд.4Лонтрел-3000,224,66 млрд.Протравители8Виал0,176,5 млрд.11Премис0,536,55 млрд.12Суми 80,77,4 млрд.14ВИАЛ-ТТ0,135,95 млрд.15Дивидент0,74,35 млрд.

Таким образом, показано, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, повышает урожайность многих сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к различным заболеваниям.

Кроме того, препарат может использоваться совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В9029. Биологический препарат, полученный на основе вышеуказанного штамма, предназначен для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям. Данная группа изобретений позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к различным заболеваниям. Препарат может быть использован совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

1. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, устойчивый к действию пестицидов, используемый для получения биологического препарата, предназначенного для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям.2. Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям, полученный путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Федорова с мелассой в течение 24-36 ч, а вторую - на той же среде в течение 48-60 ч, ферментации ведут при температуре 29±1°C, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объему воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.