ШТАММ БАКТЕРИЙ AZOTOBACTER CHROOCOCCUM, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ФИТОПАТОГЕННЫМ МИКРООРГАНИЗМАМ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/65 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.

Известно, что бактериальные препараты на основе штаммов Azotobacter chroococcum обладают способностью увеличивать урожайность ряда сельскохозяйственных культур.

Так, например, препараты на основе штаммов Azotobacter chroococcum ВКПМ-6011 (патент РФ №2074158) и Azotobacter chroococcum ВКПМ-6010 (патент РФ №2074159) повышают урожайность амаранта и зеленных культур соответственно. Однако спектр действия данных препаратов ограничен только указанными культурами.

Известен штамм Azotobacter chroococcum ВКПМ-3064 (патент РФ №1703634), обладающий антагонизмом по отношению к фитопатогенным грибам и способностью к синтезу индалил-уксусной кислоты (ИУК). Недостатком данного штамма является то, что препарат на его основе малоэффективен для зерновых культур.

Более широким спектром антагонистической активности по отношению к фитопатогенным микроорганизмам обладает штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029 (патент РФ №2289620, прототип).

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и повышающих урожайность сельскохозяйственных культур.

Поставленная задача решается тем, что получен штамм Azotobacter chroococcum К1 ВКПМ-8830, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, который может быть использован для повышения урожайности сельскохозяйственных культур (в том числе и зерновых) и повышения их устойчивости к различным заболеваниям.

Штамм бактерий Azotobacter chroococcun K выделен из огородных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях), высокая продуктивность, в том числе и на регламентных средах, способность к синтезу ИУК, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (ВКПМ) и имеет регистрационный номер ВКПМВ-8830.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

При выращивании на агаризованной питательной среде, имеющей состав (мас.%): КН₂РO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fе₂(SO₄)₃ - следы; раствор микроэлементов - 0,01; сахароза - 2,0; агар - 2,0, рН 6,8-7,2, при 29±1°С в течение 96 часов, культура образует круглые выпуклые блестящие слизистые колонии 2-4 мм, гладкие с ровным краем, непрозрачные, тягучей консистенции, при микроскопировании мелкие палочки 0,8×2,0µ, встречаются кокковидные формы.

На твердой питательной среде Берка, имеющей состав (мас.%): КН₂РО₄ - 0,08; К₂НРO₄ - 0,02; MgSO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; Fе₂(SO₄)₃ - 0,001; CaSO₄- 0,01; глюкоза -1,0; агар - 2,0, рН 6,8-7,0 после 96 часов культивирования при при 29±1°С, колонии прозрачные, в диаметре 1,5-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, круглые, выпуклые с ровными краями. При микроскопировании мелкие палочки.

При выращивании на жидкой питательной среде Федорова с мелассой (мас.%): меласса - 3,0; K₂HPO₄ - 0,03; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,05; - 0,1; K₂SO₄ - 0,02; Fe₂Cl₃ -0,001; СаСО₃ - 0,5; раствор микроэлементов - 0,01; рН 6,8-7,2 при температуре 29±1°С и непрерывном перемешивании-аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту в течение 24 часов, культура представляет собой слизистую жидкость; при микроскопировании клетки мелкие палочки, слабоподвижные; на 48 часу роста зрелые клетки полиморфные: от мелких палочек до кокковидных форм, неподвижные, образуют толстостенные цисты.

Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах 1-1,2×1,5-2,5µ. Реакция по Грамму - отрицательная.

На МПА и МПБ рост отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки

Мезофил, рост возможен в интервале 25-35 °С, оптимальная для роста температура 29±1°С.

Аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем воздуха/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.

Возможен рост при рН 6,5-8,0, оптимально для роста рН 6,5-7,2.

Отношение к источникам углеводов

Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, маннит, сорбозу, крахмал, декстрин, глицерин, этанол. Не усваивает ксилозу, арабинозу, лактозу, целлюлозу.

Таблица 1 Спектр антагонистической активности штамма Azotobacter chroococcum K1 ВКПМ-8830 Тест-культура Зона подавления роста, мм Alternaria sp. 9 Botrytis sp. 12 Cladosporium sp. 6 Fusarium brassicae 12 Fusarium lini 10 Fusarium moniliforme 5 Fusarium oxysporum 10 Fusarium vasinfectum 7 Helmintosporium sativum 8 Pythium de Baryanum 12 Scolecotrychum sp. 9 Verticillium dahliae 10 Actinomyces sp. 7 Puccinia triticina 6 Rhizoctonia sp. 10 Septoria graminum 7 Phytophtora infestans 6

Отношение к источникам азота

Хорошо растет на безазотистых средах, а также на средах с добавлением мелассы и (NH₄)₂SO₄. В качестве источников азота используют нитраты, соли аммония и некоторые аминокислоты.

Отношение к фитопатогенным грибам и бактериям

Антагонистическую активность штамма определяли методом агаровых блочков (Егоров Н.С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М.: «Высшая школа», 1965, с.131.) через 3-6 суток роста тест-культур на диагностических средах.

Штамм подавляет рост грибов Alternaria sp., Pythium de Baryanum, Fusarium oxysporum, Fusarium vasinfectum, Fusarium momliforme, Fusarium lini, Cladosporium sp., Scolecotrychum sp., Helmintosporium sativum, Botrytis sp., Verticillium dahliae и бактерий Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Septoria graminum, Actinomyces sp (таблица 1)

Штамм Azotobacter chroococcum Kl ВКПМ-8830 хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава, мас.%: КН₂РO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fе₂(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ -0,0005; СаСО₃ -0,35; меласса - 3,0; агар - 2,0 при температуре 4±2°C до 2-х лет.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Azotobacter chroococcum K1 ВКПМ-8830 в лабораторных условиях

Стерильную жидкую питательную среду состава, мас.%: КН₂РO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; Н₃ВО₃ - 0,0005; меласса - 3,0; рН 6,8-7,2 в колбах засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в колбах на качалке в течение 48 часов при температуре 29±1°C и непрерывном перемешивании. Получают вязкую жидкую культуру с титром 35 млрд/мл, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы или семян сельскохозяйственных культур.

Пример 2. Культивирование штамма Azotobacter chroococcum K1 ВКПМ-8830 в ферментере

Питательную среду по примеру 1 в инокуляторе засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в течение 36 часов при температуре 29±1°C, при непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту.

Полученной посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды засевают ферментер объемом 1 м³ с предварительно простерилизованной жидкой питательной средой, имеющей состав, мас.%: КН₂РO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; Н₃ВО₃ - 0,0005; меласса - 3,0; рН 6,8-7,2. Выращивание проводят при температуре 29±1°C, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/объем питательной среды в минуту. Продолжительность выращивания 60 часов. Получают вязкую жидкую культуру с титром 28 млрд/мл, которую используют для обработки почвы и семян.

Пример 3. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур Препарат полученный по примеру 2 применяют для проведения испытаний в открытом грунте:

- на сахарной свекле и гречихе в НИИ Агропромышленного производства, г.Курск (обработка почвы перед посевом);

- на озимой пшенице в Ульяновском НИИСХ, Ульяновская область, п.Тимирязевский (обработка почвы перед посевом);

- на картофеле во ВНИИ Картофельного хозяйства (ВНИИКХ), Московская область, пос.Коренево (обработка почвы перед посевом);

- на яровой пшенице в Приморской государственной сельхозакадемии (обработка семян перед посевом);

- на капусте белокочанной в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева, г.Москва (обработка почвы перед высадкой рассады).

В каждом случае обработку проводят из расчета 200 мл препарата/га, площадь делянки 5 га. Для удобства внесения жидкую культуру перед использованием разводят водой в 1000 раз.

В качестве контроля приведены результаты, полученные в аналогичных условиях, но без предварительной обработки почвы препаратом.

Результаты испытаний, приведенные в таблице 2, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum K1 ВКПМ-8830, оказывает положительное влияние на урожайность сельскохозяйственных культур.

Таблица 2 Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур Обрабатываемые культуры УРОЖАЙ, ц/га Прибавка урожая контроль препарат ц/га % Озимая пшеница 19,9 22,9 3,0 15,1 Сахарная свекла 279,0 413,0 134,0 48,0 Яровая пшеница 13.4 19,6 6,2 46,3 Картофель 283,0 341,0 58,0 25,0 Гречиха 9,2 10,2 1,0 10,8 Капуста белокачанная 860,0 1210, 350,0 41,0

Пример 4. Влияние препарата на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями

Опыты по изучению влияния препарата, полученного по примеру 2, на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями проводили:

- для яровой и озимой пшеницы в Ульяновском НИИСХ и в Курском НИИАПП;

- для картофеля в Брянском филиале ВНИИКХ (г.Брянск).

Обработку почвы перед посевом проводили препаратом на площади 10 га из расчета 200 мл/га.

Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum K1 ВКПМ-8830, подавляет развитие различных заболеваний сельскохозяйственных культур.

Таким образом, показано, что штамм Azotobacter chroococcum K1 ВКПМ-8830 обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, повышает урожайность многих сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к различным заболеваниям.

Таблица 3 Влияние препарата на степень поражения яровой и озимой пшеницы различными болезнями   Яровая пшеница Озимая пшеница Картофель Бурая ржавчина, % Корневая гниль. % Септориоз, % Бурая ржавчина, % Септориоз, % Фитофтороз, % Вирусные, % Ульяновский НИИСХ Контроль 48,4 12,5 - - - - - Препарат 31,0 7,0 - - - - - Курский НИИАПП Контроль 5,9 - 37,5 13,8 24,5 - - Препарат 3,2 - 29,7 7.1 20,2 - - Брянский филиал ВНИИКХ Контроль - - - - - 8,1 14,7 Препарат - - - - - 6,0 14,0

Штамм Azotobacter chroococcum K1 ВКПМ-8830, обладающий антагонистической активностью по отношению к широкому спектру фитопатогенных микроорганизмов, выделен из огородных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции. На основе полученного штамма готовят препарат для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к заболеваниям. Изобретение обеспечивает положительное влияние на урожайность сельскохозяйственных культур и увеличивает их стойкость к различным заболеваниям. 2 н.п. ф-лы, 3 табл.

1. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum К1 ВКПМ-8830, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам.

2. Применение штамма бактерий Azotobacter chroococcum К1 ВКПМ-8830 для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к заболеваниям.