СПОСОБ ПРЯМОЙ ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЭНДОТОКСИКОЗА ПРИ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЛЕГКИХ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики эндотоксикоза.

Известен способ диагностики бактериального эндотоксикоза, например, биологический, основанный на определении сроков гибели парамеций под влиянием токсического фактора плазмы или сыворотки крови (1).

Недостатками известного способа являются:

1) громоздкость исследований;

2) неспецифичность теста;

3) косвенное отражение уровня интоксикации при бактериальном эндотоксикозе;

4) не информирует о возможности морфологической изменчивости бактерий в организме при бактериальном эндотоксикозе;

5) не обнаруживает L-трансформацию бактерий в организме при бактериальном эндотоксикозе, ее этапы, варианты L-форм, их соотношения и динамику;

6) потребность в особых условиях содержания парамеций и их зависимость от многих факторов среды (температуры, рН, пищевого субстрата и др.).

Целью изобретения является повышение объективности, точности и простоты диагностики бактериального эндотоксикоза при специфических, например активном туберкулезе, и неспецифических, например абсцессе, гнойно-некротических заболеваниях легких.

Поставленная цель достигается тем, что диагностику бактериального эндотоксикоза при специфических, например активном туберкулезе, и неспецифических, например абсцессе, гнойно-некротических заболеваниях легких обеспечивает прямая электронно-микроскопическая визуализация циркулирующих в крови микроскопических и субмикроскопических бактериальных форм и их статистический анализ с учетом количества, размеров и функционального состояния.

Предложенный способ осуществляется следующим образом:

0,1 мл (одну каплю) плазмы пациента наносят на поверхность объектного столика, подсушивают ее на поверхности объектного столика, напыляют углеродом в вакуумной установке и просматривают в сканирующем электронном микроскопе, например, JEOL jsm-35C (Япония).

Выбор в качестве тест-показателей бактериального эндотоксикоза микроскопических и субмикроскопических бактериальных форм базируется на том, что бактерии, вызвавшие специфическое, например активный туберкулез, либо неспецифическое, например абсцесс, заболевание легких под влиянием комплекса из продуктов распада тканевых белков организма, биологически активных аминов, средне- и низкомолекулярных токсинов, свободнорадикального окисления и других веществ, подвергаются морфологической изменчивости. При этом возникает бактериемия, например, при активном туберкулезе легких в виде отчасти исходных бактериальных клеток (ИБК), нитевидных бактериальных структур (НБС) и вариантов L-форм бактерий - различной величины конгломератов (К), формирующихся из шаровидных клеток, и элементарных телец (ЭТ) диаметром 0,3-0,15 мкм и даже меньше, а при абсцессе легких, например, стафилококковой природы - несбалансированного роста клеток (НРК) стафилококка (дискоординации между ростом и размножением клеток) как проявление начальных этапов L-трансформации, деформированных шаровидных клеток (ДШК), К и ЭТ.

В опытной группе обследовано 39 взрослых больных с гнойно-некротическими заболеваниями легких различной выраженности, например активным туберкулезом или же стафилококковым абсцессом легких. Контрольную группу составили 15 здоровых лиц, в плазме крови которых бактериальные формы не обнаружены.

В зависимости от нахождения в крови пациентов с гнойно-некротическими заболеваниями легких, например при активном туберкулезе или стафилококковом абсцессе, морфологически измененных бактерий, их количества, размеров и функционального состояния (размножение, продукция К или ЭТ) дифференцируются три степени тяжести бактериального эндотоксикоза (табл.1):

1 степень тяжести - легкая. В препаратах из плазмы крови больных активным туберкулезом легких (фиг.2 а-б) обнаруживаются ИБК, тонкие и широкие НБС, отпочковывающие на поверхности ЭТ, свободнолежащие ЭТ и мелкие, до 5 мкм, К. Количество ИБК равно 3,0±0,49 (n=10, p<0,001), НБС - 6,0±0,57 (n=10, р<0,001), ЭТ - 44,0±3,75 (n=7, р<0,001), К - 6,0±0,5 (n=9, р<0,001), где n - количество просмотренных полей зрения. При стафилококковом абсцессе легких в плазме крови выявляются (фиг.1 а) овальные клетки стафилококка на стадии НРК (2,0±0,06, р<0,001) и ЭТ (14,0±1,87, р<0,001), где n - количество просмотренных полей зрения. По клиническим признакам самочувствие пациентов при активном туберкулезе и абсцессе диаметром до 2 см удовлетворительное, исход заболевания благоприятный.

2 степень тяжести - средняя. В препаратах из плазмы крови больных активным туберкулезом легких (фиг.2 в-г) прослеживается увеличение численности НБС, часто переплетающихся между собою, различных по форме и размерам (до 10 мкм) К, которые формируются на поверхности НБС, и множество свободнолежащих ЭТ. При этом количество НБС составляет 14,0±0,57 (n=12, р<0,001), К - 7,0±0,91 (n=10, р<0,001), ЭТ - 175,0±14,70 (n=8, р<0,001), где n - число просмотренных полей зрения. ИБК отсутствуют. При стафилококковом абсцессе легких диаметром 2-6 см в плазме крови просматриваются (фиг.1 б) мелкие К - 5,0±0,46 (n=8, р<0,001) и ЭТ - 6,0±0,7 (n=8, р<0,001). По клиническим признакам состояние пациентов, страдающих активным туберкулезом или абсцессом диаметром 2-6 см, средней тяжести, исход заболевания благоприятный.

3 степень тяжести - тяжелая. В препаратах из плазмы крови больных туберкулезом легких (фиг.2 д-е) ИБК и НБС практически не обнаруживаются. В крови циркулируют лишь крупные полиморфные К, достигающие длиною 28-65 мкм и шириною 10-35 мкм, и свободно лежащие ЭТ. Количество К - 14,0±1,23 (n=10, р<0,001), ЭТ - 14,0±1,4 (n=8, р<0,001), где n - количество просмотренных полей зрения. При стафилококковом абсцессе легких диаметром больше 6 см в плазме крови обнаруживаются (фиг.1 в) конгломераты величиною до 5 мкм, деформированные шаровидные клетки и различных размеров ЭТ. Количество К составляет 3,0±0,21 (n=10, р<0,001), ДШК - 2,0±0,042 (n=10, р<0,001), ЭТ - 6,0±0,63 (n=10, р<0,001), где n - число просмотренных полей зрения. По клиническим признакам состояние пациентов тяжелое, лечебные мероприятия при активном туберкулезе и осложненном абсцессе (эмпиема плевры) не помогают. Летальный исход при активном туберкулезе легких наступает через 1-2 недели, при осложненном стафилококковом абсцессе легких - в 9% случаев.

Пример 1. Больной С., 1970 г.р. поступил с диагнозом: инфильтративный туберкулез легких, локализованный в верхней доле правого легкого, фаза распада. Заболевание диагностировано впервые. Жалобы на редкий кашель, утомляемость при физической нагрузке. Общее состояние удовлетворительное. Микобактерии туберкулеза в мокроте не выявлены. На рентгенограмме: в верхней доле правого легкого неоднородная малоинтенсивная тень с просветлением в центре. Анализ крови: число лейкоцитов в 1 мкл 5700, нейтрофильных лейкоцитов: палочкоядерных - 3%, сегментоядерных - 61%. Лимфоциты - 18%. СОЭ - 9 мм/ч. При просмотре плазмы крови в сканирующем электронном микроскопе обнаружены 3 исходные бактериальные клетки, 6 различного размера нитевидных бактериальных структур, 41 элементарных телец и 6 мелких конгломерата. «Парамецийное время» - 13,2 минуты. Диагностирован бактериальный эндотоксикоз легкой степени тяжести. Исход заболевания благоприятный.

Пример 2. Б-я Г., 1951 г.р. поступила с диагнозом: инфильтративный туберкулез в нижней доле правого легкого, фаза распада и обсеменения. Сопутствующее заболевание - сахарный диабет. Больна с весны 2004 г. По клиническим признакам состояние средней тяжести. Жалобы на кашель, слабость. В мокроте найдены микобактерии туберкулеза. На рентгенограмме: в нижней доле правого легкого неоднородная тень с деструкцией и очагами обсеменения. Анализ крови: число лейкоцитов в 1 мкл 5800, нейтрофильных лейкоцитов: палочкоядерных - 3%, сегментоядерных - 80%. Лимфоцитов - 17%. СОЭ - 32 мм/ч. При просмотре плазмы крови в сканирующем электронном микроскопе обнаружены различной ширины и длины 14 НБС, которые отпочковывают ЭТ. Вокруг нитевидных структур 165 свободнолежащих ЭТ и 7 К. «Парамецийное время» - 10,1 мин. Диагностирован бактериальный эндотоксикоз средней степени тяжести. Исход заболевания благоприятный.

Пример 3. Б-й Т., 1961 г.р. поступил с диагнозом: диссеминированный туберкулез легких, фаза инфильтрации и распада. Туберкулез гортани. Считает себя больным с весны 2004 г. По клиническим признакам состояние крайне тяжелое. Жалобы на одышку, потливость, охриплость голоса, повышенную температуру тела. В мокроте содержаться микобактерии туберкулеза. На рентгенограмме: в верхнесредних отделах обоих легких множественные очаговые тени различной интенсивности. В верхней и нижней долях правого легкого обнаружены каверны. Анализ крови: количество лейкоцитов в 1 мкл 15600, нейтрофильных лейкоцитов: палочкоядерных - 8%, сегментоядерных - 64%. Лимфоцитов - 16%, моноцитов - 12%. СОЭ - 67 мм/ч. При просмотре плазмы крови в сканирующем электронном микроскопе обнаружены 13 крупных конгломерата и 15 свободнолежащих ЭТ. ИБК и НБС не выявлены. «Парамецийное время» - 6,1 мин. Заключение: бактериальный эндотоксикоз тяжелой степени. Летальный исход наступил через неделю после госпитализации.

Пример 4. Б-й О., 1973 г.р. поступил в клинику Института физиологии и патологии дыхания СО РАМН с диагнозом: абсцедирующая пневмония средней доли правого легкого. Болеет «гриппом» вторую неделю. По клиническим признакам состояние удовлетворительное. Беспокоит кашель с выделением небольшого количества мокроты, повышение температуры по вечерам, плохой аппетит, неприятные ощущения в правой половине грудной клетки. На рентгенограмме: затенение средней доли правого легкого, в центре тени - просветление (полость) диаметром 1,5 см. Анализ крови: количество лейкоцитов в 1 мкл 9700, палочкоядерных лейкоцитов - 5%, сегментоядерных лейкоцитов - 63%. Количество лимфоцитов - 27%, моноцитов - 5%. СОЭ - 21 мм/ч. При просмотре плазмы крови в сканирующем электронном микроскопе обнаружены: НРК - 2, свободнолежащие ЭТ - 15. ИБК, НБС, ДШК и К не выявлены. «Парамецийное время» - 19 мин. Заключение: бактериальный эндотоксикоз легкой степени тяжести.

Пример 5. Б-я Ф., 1954 г.р. поступила в клинику Института физиологии и патологии дыхания СО РАМН с диагнозом: абсцесс нижней доли правого легкого, токсический миокардит, токсический гепатит, токсический нефрит. Считает себя больной на протяжении двух недель. По клиническим признакам состояние средней тяжести. Жалобы на высокую температуру, общую слабость, одышку, кашель с выделением мокроты неприятного запаха. На рентгенограмме: в нижней доле правого легкого имеется полость размером 4×6 см с наличием небольшого количества жидкости и обширным перифокальным воспалением. Анализ крови: количество лейкоцитов в 1 мкл 17600, палочкоядерных лейкоцитов - 15%, сегментоядерных лейкоцитов - 54%. Количество лимфоцитов - 21%, моноцитов - 10%. Токсическая зернистость нейтрофилов ++(50%). СОЭ - 32 мм/ч. При просмотре плазмы крови в сканирующем электронном микроскопе обнаружены 5 мелких конгломератов и 6 свободнолежащих ЭТ. ИБК, НРК, НБС, ДШК не выявлены. «Парамецийное время» - 9 мин. Заключение: бактериальный эндотоксикоз средней степени тяжести.

Пример 6. Б-й К., 1969 г.р. поступил в клинику Института физиологии и патологии дыхания СО РАМН с диагнозом: абсцессы нижней доли левого легкого, абсцесс средней доли правого легкого. Токсический миокардит, токсический гепатит. Сепсис. Простудился во время охоты, к врачу не обращался, лечился домашними средствами. За день до госпитализации во время кашля отошло большое количество гнойной мокроты с прожилками крови. По клиническим признакам состояние крайне тяжелое. Жалобы на высокую температуру, кашель с выделением большого количества мокроты неприятного запаха, слабость, одышку, боли в области сердца, отечность голеней и стоп. На рентгенограмме: в нижней доле левого легкого выявлены два абсцесса диаметрами 3 см и 10 см, содержащих жидкость. В средней доле правого легкого абсцесс диаметром 5 см с перифокальным воспалением. Анализ крови: количество лейкоцитов в 1 мкл 22000, палочкоядерных лейкоцитов - 18%, сегментоядерных лейкоцитов - 50%. Количество лимфоцитов - 24%, моноцитов - 8%. Токсическая зернистость нейтрофилов +++(75%). СОЭ - 44 мм/ч. При просмотре плазмы крови в сканирующем электронном микроскопе обнаружены 3 крупных конгломерата, 2 ДШК и 6 свободнолежащих ЭТ. ИБК и НБС не выявлены. «Парамецийное время» - 6 мин. Заключение: бактериальный эндотоксикоз тяжелой степени. Через двое суток во время кашля у больного возник спонтанный пневмоторакс слева, развилась эмпиема плевры. Летальный исход наступил спустя 5 суток.

Предложенный способ прямой электронно-микроскопической диагностики бактериального эндотоксикоза при гнойно-некротических заболеваниях легких (туберкулез, абсцесс), по сравнению с известным, позволяет не только унифицировать диагностику, повысит ее эффективность, точность и качество, но и визуализировать циркулирующие в крови на определенных этапах бактериального эндотоксикоза микроскопические и субмикроскопические формы бактерий, особенно L-формы, динамику их количества, способ образования и тем самым позволяет утверждать существование именно бактериального эндотоксикоза той или иной степени тяжести.

Литература

1. Пафомов Г.А., Бурдыга Ф.А., Широнова М.А. Экспресс-метод определения токсических свойств крови и лимфы с помощью парамеций при экзо- и эндотоксикозах // Сов. Мед. - 1980. - №1. - С.42-45.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики бактериального эндотоксикоза при гнойно-некротических заболеваниях легких. Сущность способа: 0,1 мл плазмы наносят на торцевую поверхность объектного столика электронного микроскопа, после ее подсыхания напыляют углеродом в вакуумной установке, просматривают в сканирующем электронном микроскопе, учитывают визуализированные в плазме крови исходные бактериальные клетки (ИБК), несбалансированный рост клеток (НРК), нитевидные бактериальные структуры (НБС), конгломераты (К), деформированные шаровидные клетки (ДШК) и элементарные тельца (ЭТ) L-форм бактерий и по их наличию, количеству, размерам и функциональному состоянию диагностируют степень тяжести бактериального эндотоксикоза при активном туберкулезе легких и абсцессе легких стафилококковой природы. Использование способа позволяет повысить объективность и точность диагностики, дает возможность визуализировать циркулирующие в крови на отдельных этапах эндотоксикоза микроскопические и субмикроскопические формы бактерий, динамику их количества, место образования. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

1. Способ диагностики степени тяжести бактериального эндотоксикоза при гнойно-некротических заболеваниях легких, включающий исследование плазмы крови, отличающийся тем, что 0,1 мл плазмы наносят на торцевую поверхность объектного столика электронного микроскопа, после ее подсыхания напыляют углеродом в вакуумной установке, просматривают в сканирующем электронном микроскопе, учитывают визуализированные в плазме крови исходные бактериальные клетки (ИБК), несбалансированный рост клеток (НРК), нитевидные бактериальные структуры (НБС), конгломераты (К), деформированные шаровидные клетки (ДШК) и элементарные тельца (ЭТ) L-форм бактерий и по их наличию, количеству, размерам и функциональному состоянию диагностируют степень тяжести бактериального эндотоксикоза.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при активном туберкулезе легких при наличии ИБК (3,0±0,49), НБС (6,0±0,57), ЭТ (44,0±3,75), К (6,0±0,5) диагностируют легкую степень; при наличии НБС (14,0±0,57), ЭТ (175,0±14,70), К (7,0±0,91) диагностируют среднюю степень и при наличии крупных К (14,0±1,23) и ЭТ (14,0±1,4) диагностируют тяжелую степень бактериального эндотоксикоза.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при абсцессе легких стафилококковой природы при наличии несбалансированного роста клеток (НРК) как проявления начальных этапов L-трансформации стафилококка (2,0±0,06) и ЭТ (14,0±1,87) диагностируют легкую степень; при наличии мелких К (5,0±0,46) и ЭТ (6,0±0,7) диагностируют среднюю степень и при наличии К (3,0±0,21), ДШК (2,0±0,042) и ЭТ (6,0±0,63) диагностируют тяжелую степень бактериального эндотоксикоза.