ПРИМЕНЕНИЕ ФЛАВОЛИГНАНОВ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ИЗБЫТОЧНОЙ И ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ Российский патент 2007 года по МПК A61K36/28 A61P35/00 

Предлагаемое изобретение относится к области химии природных соединений, биотехнологии, фармакологии и медицине и может быть использовано при разработке лекарственных препаратов для терапии патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза, а именно для подавления избыточной или патологической пролиферации эндотелия сосудов.

Изобретение касается применения флаволигнанов, выбранных из силибинина, силидианина, силикристина, дегидросилибина, их смесей или содержащих их экстракты из расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn), для подавления избыточной или патологической пролиферации эндотелия сосудов.

Ангиогенез представляет собой процесс формирования новых кровеносных сосудов из предсуществующих, играющий ключевую роль в широком спектре физиологических и патологических процессов. Ряд нормальных физиологических процессов, таких как эмбриональное развитие, заживление ран и менструальный цикл, зависит от формирования новых сосудов, поставляющих кислород и питательные вещества, а также утилизирующих продукты обмена. Во взрослом здоровом организме ангиогенез находится под жестким контролем регуляторных систем организма, обеспечивающих баланс между позитивными и негативными регуляторами ангиогенеза, и, в основном, поддерживается на низком уровне или носит периодический и кратковременный характер. Неадекватная или несбалансированная васкуляризация является причиной многочисленных патологических состояний, связанных с формированием новой сосудистой сети. При некоторых заболеваниях избыточный ангиогенез является патологическим процессом. Среди этих заболеваний рак, кардиососудистые заболевания (атеросклероз), хронические воспалительные процессы, диабеты (диабетическая ретинопатия, диабетическая неоваскуляризация), псориаз, эндометриоз и ожирение, ретинопатия недоношенных, отторжение роговичного трансплантата, неоваскулярная глаукома, дефицит витамина А, долгое ношение контактных линз, различные виды кератита, юношеские розовые угри, неоваскулярная болезнь глаз, туберкулезная инфекция, ревматоидный артрит, полиартериит, системная красная волчанка, серповидно-клеточная анемия, закупорка вен и артерий, ретинит, близорукость, хроническое отслоение сетчатки, рубцевание, ангиогенез при ишемии конечностей, дегенерация желтого пятна. При лечении подобного рода заболеваний может оказаться полезным ингибирование ангиогенеза.

В последние годы научным сообществом уделялось большое внимание разработке терапевтических стратегий, направленных на подавление ангиогенного каскада при развитии злокачественного опухолевого процесса. Также подавление процесса васкуляризации может играть важную роль в случаях заболеваний, связанных с хроническими воспалительными процессами, такими как ревматоидный артрит. С середины 80-х годов прошлого столетия ведется активный поиск, характеристика и исследование терапевтического потенциала антиангиогенных агентов, список которых постоянно пополняется. Все расширяющийся круг антиангиогенных препаратов, используемых для медицинских целей, свидетельствует о том, что антиангиогенная терапия заняла прочную позицию в практической медицине, и ее потенциал далеко не исчерпан, и можно с уверенностью сказать, что интенсивность исследований в этой области будет расти в последующие годы.

В настоящее время данные, касающиеся антиангиогенных эффектов лекарственных средств у пациентов, страдающих от хронических воспалительных заболеваний, достаточно ограничены. Начато одно исследование по терапии макулопатии. Тип возрастной макулопатии, при котором в патогенезе ведущую роль играет неоваскуляризация, является основной причиной слепоты и ухудшения зрения у людей, достигших 60 и более лет. II фаза клинических испытаний будет оценивать безопасность ингибитора ангиогенеза AG3340 у приблизительно 100 пациентов в возрасте 50 лет и старше, пораженных этой болезнью, и определит оптимальную дозу и схему применения препарата в последующей III фазе испытаний.

Одно из первых исследований по изучению фармакологических эффектов ингибирования ангиогенеза при хроническом воспалительном заболевании показало, что антиангиогенный аналог фумагиллина TNP-470 может предупреждать развитие и даже полностью излечивать запущенный артрит у крыс. При сочетанной терапии TNP-470 с таксолом, подавляющим митоз, миграцию, хемотаксис и внутриклеточные транспортные процессы, наблюдался еще более значительный терапевтический эффект в отношении артрита. При атеросклерозе также велика роль ангиогенеза. Лечение мышей TNP-470 в течение 16 недель приводило к подавлению роста бляшек на 85%.

Талидомид - лекарственный препарат, первоначально применявшийся в медицине в качестве седативного противовоспалительного средства, который к настоящему времени был испытан на людях применительно ко многим заболеваниям, среди которых ревматоидный артрит и желудочно-кишечные язвы. Он также может подавлять ангиогенез, вероятно, за счет подавления экспрессии эндотелиального интегрина. Эффективность талидомида была продемонстрирована для нескольких пациентов с тяжелой формой болезни Крона. В открытом контролируемом исследовании 9 из 22 пациентов либо с люминальной формой болезни, либо со свищевой достигали клинической ремиссии.

В настоящее время описаны фармацевтические композиции, подавляющие избыточную пролиферацию сосудов при различных нарушениях ангиогенеза (заявки РФ на изобретение №2004102900 и №2003124748). В заявке РФ №2004102900 заявители для лечения патологий, связанных с избыточным ангиогенезом, предлагают использовать пептиды для ингибирования экспрессии фактора роста сосудистого эндотелия, являющегося главным фактором, стимулирующим ангиогенез. В заявке РФ №2003124748 лечение заболеваний, связанных с нарушениями ангиогенеза, предлагается проводить с помощью пептидных агонистов рецептора соматостатина. Несмотря на очевидную перспективность данных подходов, нельзя не отметить и их существенные недостатки, к числу которых относятся быстрая деградация пептидов в кровяном русле, высокая скорость их выведения, а также значительно более низкое сродство пептидов к рецептору по сравнению с физиологическими лигандами. В связи с этим представляется актуальным поиск иных подходов, направленных на подавление избыточной васкуляризации при различных патологиях.

В патенте США №6538038 (2000 г.) предлагается использовать для подавления гиперваскуляризации фосфорилированные производные препаратов, таких как комбретастатин, таксаны, винкаалкалоиды, колхицины, подофиллотоксины и др. Заявляемые препараты после их введения и распределения в организме подвергаются воздействию специфических ферментов эндотелия сосудов, образуя активные соединения, оказывающие ингибирующее воздействие в отношении эндотелиальных клеток. Однако получение подобных препаратов включает в себя сложные стадии химического синтеза, что значительно удорожает стоимость препаратов и, соответственно, курса терапии. В то же время флаволигнаны, которые легко можно получить как в чистом виде, так и в виде смеси из доступного природного источника - расторопши пятнистой - до сих пор оставались невостребованными при лечении патологий, связанных с избыточной васкуляризацией.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала лекарственных средств, направленных на лечение патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза, а именно для подавления избыточной или патологической пролиферации эндотелия сосудов.

В рамках изобретательской задачи предлагается применение флаволигнанов, выбранных из силибинина, силидианина, силикристина, дегидросилибина, их смесей или содержащих их экстракты из расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn), для подавления избыточной или патологической пролиферации эндотелия сосудов.

Известны гепатопротекторные препараты плодов расторопши пятнистой - Карсил, Легален, Силибор - представляющие собой сумму флаволигнанов. Экстракт расторопши пятнистой состоит из силимарина, представляющего собой смесь флаволигнанов силибинина, силидианина и силикристина (М.Д.Машковский. Лекарственные средства, М., 1993 г., т.1).

Подобные патологии могут иметь место при диабетической ретинопатии, ретинопатии недоношенных, обтурирующей болезни сосудов сетчатки, склеродермии, атеросклерозе, возрастной макулопатии, эндометрите, ревматоидном артрите, кардиососудистых заболеваниях (атеросклерозе), хронических воспалительных процессах, диабетах (диабетическая ретинопатия, диабетическая неоваскуляризация), псориазе, эндометриозе и ожирении, отторжении роговичного трансплантата, неоваскулярной глаукоме, дефиците витамина А, долгом ношении контактных линз, различных видах кератита, юношеских розовых угрях, неоваскулярной болезни глаз, туберкулезной инфекции, ревматоидном артрите, полиартериите, системной красной волчанке, серповидно-клеточной анемии, закупорке вен и артерий, ретините, близорукости, хроническом отслоении сетчатки, рубцевании, ангиогенезе при ишемии конечностей, дегенерации желтого пятна.

Изобретательская задача решается тем, что предлагается использовать флаволигнаны, выбранные из силибинина, силидианина, силикристина, дегидросилибина, их смесей или содержащие их экстракты из расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn), для подавления избыточной или патологической пролиферации эндотелия сосудов.

В основе изобретения лежит новое свойство флаволигнанов, способных подавлять избыточную или патологическую пролиферацию эндотелии сосудов, которое может быть использовано для лечения широкого спектра заболеваний, связанных с нарушением ангиогенеза. Это изобретение позволяет расширить арсенал лекарственных средств, направленных на лечение патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза. Препарат флаволигнанов может быть легко получен с помощью стандартных биотехнологических и химических методов, отличается стабильностью и технологичностью получения, может быть использован для лечения целого ряда патологий. Таким образом, изобретение полностью соответствует критерию "изобретательский уровень".

Изобретение подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Оценка цитотоксической активности силимарина в отношении эндотелиальных клеток человека.

Эндотелиальные клетки пупочной вены зародыша человека (HUVEC) из монослоя трипсинизировали и ресуспендировали в среде M199 с добавкой 5%-ного раствора фетальной бычьей сыворотки. Затем клетки рассеивали в 96-ти луночные планшеты, покрытые желатином, в плотности 5 тыс. клеток в лунку. Через 24 часа добавляли исследуемые препараты в диапазоне концентраций 5-200 мкМ (в пересчете на силибинин). По прошествии 20 минут культуры клеток обрабатывали раствором основного фактора роста фибробластов в концентрации 5 нг/мл в присутствии гепарина (1 мкг/мл). Выживаемость клеток в контрольной и в обработанной полученным препаратом группах определяли с помощью МТТ-теста через 72 часа инкубации.

Данные о цитотоксической активности исследованных флаволигнанов и их комбинаций в отношении пролиферирующих эндотелиальных клеток приведены в табл.1 (IC₅₀ - концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток).

ПрепаратIC₅₀силибинин22 мкМсиликристин28 мкМсилидианин36 мкМ1/2 силибинин + 1/2 дегидросилибин24 мкМ1/2 силибинин + 1/2 силикристин25 мкМсилимарин (смесь силибинина, силикристина и силидианина)30 мкМфосфокомбретастатин68 мкМ

Данные о влиянии силимарина (смеси флаволигнанов из экстракта расторопши пятнистой), взятого в различных концентрациях (в пересчете на силибинин), на выживаемость клеток HUVEC приведены на фиг.1. Силимарин оказывал выраженное дозозависимое ингибирующее действие в отношении пролиферации клеток исследованной линии.

Пример 2. Влияние смеси флаволигнанов из расторопши пятнистой на образование капилляров в матригеле.

Для исследования влияния заявленных флаволигнанов на процесс ангиогенеза использовали in vitro анализ развития капилляров в матригеле, имитирующем препарат внеклеточного матрикса. Данный метод достаточно полно отражает процесс неоваскуляризации, происходящий in vivo.

Эндотелиальные клетки пупочной вены зародыша человека HUVEC рассаживали (по 50 тыс. клеток на лунку) в 24-луночные планшеты, предварительно покрытые матригелем. Образование капилляроподобных структур наблюдали методом фазово-контрастной микроскопии. Через 8 ч в лунки добавляли силимарин (препарат смеси флаволигнанов из расторопши пятнистой) в диапазоне концентраций 5-100 мкМ (в пересчете на силибинин). Через 24 ч после добавления силимарина подсчитывали количество образовавшихся капиллярных трубок.

Результаты исследования приведены на фиг.2. Как видно из приведенной диаграммы, применение силимарина дозозависимо препятствует образованию капилляроподобных структур из эндотелиальных клеток человека в матригеле.

Изобретение относится к области фармакологии и медицине и может быть использовано при разработке лекарственных препаратов для терапии патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза, а именно для подавления избыточной или патологической пролиферации эндотелия сосудов. Средство представляет собой флаволигнаны, выбранные из силибинина, силидианина, силикристина, дегидросилибина, их смесей или содержащие их экстракты из расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn), для подавления избыточной или патологической пролиферации эндотелия сосудов. Данное средство расширяет арсенал средств, направленных на лечение патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза. 1 табл., 2 ил.

Применение флаволигнанов, выбранных из силибинина, силидианина, силикристина, дегидросилибина, их смесей или содержащих их экстрактов из расторопши пятнистой (Silybwn marianum (L.) Gaertn), в качестве лекарственных средств для подавления избыточной и патологической пролиферации эндотелия сосудов.